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5 000 个/孔接种于 24 孔超低黏附板中，每组设置 3 个复 度值的比值表示目的蛋白的表达水平。试验重复3次。
孔。每孔中加入2 mL悬浮成球试验培养基（含5 μg/mL 2.8 U0126抑制ERK蛋白表达后对E2转化细胞克隆形
胰 岛 素 、2％ B-27 添 加 物 、20 ng/mL EGF、20 ng/mL 成能力、自我更新能力以及干性标志物表达的影响
FGFB、1 μg/mL 氢化可的松和 1％青链霉素的 DMEM/ 取对数生长期的 E2转化细胞，随机分为对照组（含
F12 培养基），在培养箱中培养 10 d 后，于显微镜下拍照 0.1％DMSO）和 U0126（ERK 抑制剂）组（10 μmol/L）。
并对每组的成球情况进行计数。试验重复3次。 分别按“2.4”项下方法检测细胞的克隆形成能力，按
2.6 实 时 荧 光 定 量 -PCR 试 验 检 测 细 胞 中 CD44、 “2.5”项下方法检测细胞自我更新能力，按“2.7”项下方
Nanog、OCT4、ERK mRNA的表达情况 法检测细胞中 CD44、Nanog、OCT4 和 p-ERK 蛋白的表
取“2.2”项下 3 组对数生长期细胞，分别按 2×10 5 达情况（以α-tubulin 为内参，稀释比例为 1 ∶ 10 000）。试
个/孔接种于6孔板中，每组设置2个复孔。待细胞贴壁 验均重复3次。
后，以 DMEM/F12 培养基（不含血清）于培养箱中培养 2.9 统计学方法
48 h。按照 Trizol 说明书方法操作，分离提取细胞中的 采用 SPSS 11.5 软件对数据进行统计处理和分析。
总 RNA，用超微量分光光度计测定各组 RNA 浓度。使 数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两
用 PrimeScript TM RT reagent Kit 试剂盒并按说明书方法 独立样本组间比较采用 t 检验。P＜0.05 表示差异具有
操作，将 1 μg 总 RNA 逆转录为 cDNA，并以 cDNA 为模 统计学意义。
板进行PCR扩增。反应体系：cDNA模板2 μL，上、下游 3 结果
引物各0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ 10.4 μL、无酶 3.1 Calpeptin对E2转化细胞形态学特征的影响
®
水 6 μL，总体系为 20 μL。反应条件：95 ℃预变性 30 s； 细胞形态学观察发现，与对照组比较，E2转化组细
95 ℃变性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循 胞形态发生了明显变化，细胞呈长梭形贴壁生长，细胞
环。以GAPDH为内参，采用2 －ΔΔc t 法计算CD44、Nanog、 体积变大，具有一定的间质细胞样特征；E2 转化+Cal-
OCT4 和 ERK mRNA 的表达水平（其中 ct表示每个反应
peptin组细胞形态与对照组接近。各组细胞形态学特征
管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数）。 显微图见图1。
试验重复3次。引物序列及扩增产物长度见表1。
表1 引物序列及扩增产物长度
Tab 1 Primer sequence and the length of amplified
products
引物名称 上游（5′→3′） 下游（5′→3′） 产物长度，bp
CD44 CTGCCGCTTTGCAGGTGTA CATTGTGGGCAAGGTGCTATT 109
Nanog TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG 116
OCT4 GTGTTCAGCCAAAAGACCATCT GGCCTGCATGAGGGTTTCT 119 A. 对照组 B. E2转化组
ERK CTCAAGCCTTCCAACCTC TTCCACGGCACCTTATTT 180
GAPDH GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 197
2.7 Western bloting 试验检测细胞中 CD44、Nanog、
OCT4、ERK和p-ERK蛋白的表达情况
取“2.2”项下3组对数生长期细胞，分别按“2.6”项下
方法进行细胞接种、培养，然后以RIPA蛋白裂解液提取
C. E2转化+Calpeptin组
总蛋白，再以BCA法进行蛋白定量后进行制样。蛋白样
图1 各组细胞的形态学特征显微图（×200）
品在80 V电压下电泳30 min后，调节电压至120 V继续
Fig 1 Micrographs of orphological characteristic of
电泳 1 h；然后以电流 300 mA 转膜[聚偏氟乙烯（PVDF）
cells in each group（×200）
膜]1.5 h，以5％脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入稀释比
例均为 1 ∶ 1 000 的 CD44、Nanog、OCT4、ERK、p-ERK 一 3.2 Calpeptin对E2转化细胞增殖能力的影响
抗和稀释比例为 1 ∶ 10 000 的 GAPDH 一抗，4 ℃下孵育 培养24、48 h后，与对照组比较，E2转化组细胞的增
过夜；以 1×TBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 min；加入相应 殖率均显著升高（P＜0.01）；与 E2转化组比较，E2转化+
二抗（稀释比例均为 1 ∶ 10 000），室温下孵育 1 h；以 1× Calpeptin 组细胞的增殖率均显著降低（P＜0.01）。各组
TBST溶液洗膜3次，每次10 min，再用ECL发光试剂盒 细胞增殖率测定结果见表2。
显色。以凝胶成像系统成像，并用 Image J 1.8.0 软件分 3.3 Calpeptin对E2转化细胞克隆形成能力的影响
析，以目的蛋白条带灰度值与内参 GAPDH 蛋白条带灰 与对照组比较，E2转化组细胞的克隆形成率显著升

·1552 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 13 中国药房 2020年第31卷第13期