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入终浓度为 10、20、30 μmol/L 的木香烃内酯培养液，每
组设 5 个复孔，然后培养 48 h 后，弃去培养基，于 4 ℃下
用4％多聚甲醛溶液固定30 min；用PBS洗涤细胞2次，
每次 3～5 min；加入 500 μL Hoechst 33258 染色液，室温
避光染色 10 min，吸除染色液，用 PBS 洗涤 2 次，每次
3～5 min；然后置于倒置荧光显微镜下观察，每孔随机选
择5个视野拍照。镜下可见，凋亡细胞的荧光强度比正
常细胞要高，且细胞核会出现致密的浓染或呈碎块状致
密浓染。利用图像分析软件 Image-Pro Plus 6.0 计数凋
亡细胞数和细胞总数，并计算细胞凋亡率[细胞凋亡率
（％）＝凋亡细胞数/细胞总数×100％]。
2.4 木香烃内酯对SK-BR-3细胞迁移的影响考察
取对数生长期的 SK-BR-3 细胞，以 5×10 个/孔的密
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度接种于 6 孔板中，每孔加入 2 mL 完全培养基，于细胞
培养箱中培养至细胞完全铺满，然后用200 μL移液枪枪
头在单层细胞上作“一”字划痕。随后用PBS洗涤2次，
对漂浮细胞和损伤细胞进行清洗和去除，之后将细胞分
为空白对照组和木香烃内酯 10、20、30 μmol/L 浓度组。
空白对照组加入无血清培养液2 mL，木香烃内酯给药组
分别加入终浓度为 10、20、30 μmol/L的木香烃内酯培养
液，每组设3个复孔。细胞在培养0、24、48 h后用倒置显
微镜观察其愈合情况并拍照。利用Image J V1.8.0软件
分析并计算细胞的迁移率[细胞迁移率（％）＝（0 h 划痕
面积－培养后划痕面积）/0 h划痕面积×100％]。
2.5 木香烃内酯对 SK-BR-3 细胞中 Bcl-2、Bax、Cas-
pase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响考察
采用 Western blotting 法进行检测。取对数生长期
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的SK-BR-3细胞，以 1×10 个/瓶的密度接种于细胞培养
瓶中，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和木香烃
内酯 10、20、30、40 μmol/L 浓度组（增加 40 μmol/L 浓度
组以反映凋亡相关蛋白表达水平的变化趋势）。空白对
照组加入 3 mL 完全培养基，试验组分别加入终浓度为
10、20、30、40 μmol/L 的木香烃内酯培养液，每组设 3 个
复瓶，分别培养 48 h。收集各组细胞，加入预先配制的
RIPA 细胞裂解液（内含 1％的 PMSF 及 1％磷酸酶抑制
剂）100 μL，于冰上裂解 30 min 后，于 4 ℃下以 13 500
r/min离心10 min，提取总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒
测定蛋白浓度。取蛋白变性后，进行十二烷基硫酸钠-
聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳，然后转膜，以 5％脱脂奶
粉在 4 ℃封闭 12 h；TBST 缓冲液清洗，然后加入兔抗
Caspase-3、Bax、Bcl-2 、Cleaved Caspase-3、GAPDH 一抗
（1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育过夜；TBST 缓冲液清洗，加入
HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗（1 ∶ 2 000），室温孵育 3 h；
TBST 缓冲液清洗，用 ECL 显色剂显色，利用化学发光
成像系统曝光并拍照。运用 Quantity One V4.6.6图像分
析软件检测条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算各目
的蛋白相对表达水平。
·1344 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11
2.6 统计学分析
采用 GraphPad Prism 6.0 软件对数据进行统计分
析。计量资料以 x±s 表示，组间比较采用 t 检验。P＜
0.05 表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 木香烃内酯对SK-BR-3细胞增殖的影响
与空白对照组比较，木香烃内酯作用 24、48、72 h
时，各药物浓度组细胞的增殖抑制率均显著升高（P＜
0.05或P＜0.01），且呈明显的浓度和时间依赖趋势。木
香烃内酯在 10、20、30 μmol/L 浓度下作用 48 h 后，表现
出较为明显的细胞增殖抑制作用，故选择 10、20、30
μmol/L 作用 48 h 进行后续试验。各组细胞增殖抑制率
测定结果见表1。
表1 各组细胞增殖抑制率测定结果（x±±s，n＝5）
Tab 1 Inhibitory rate of proliferation of cells in each
group（x±±s，n＝5）
细胞增殖抑制率，％
组别
24 h 48 h 72 h
空白对照组 0 0 0
木香烃内酯10 μmol/L浓度组 10.228±4.357 ＊ 16.219±3.262 ＊ 36.046±5.605 ＊＊
木香烃内酯20 μmol/L浓度组 54.543±3.190 ＊＊ 65.205±3.171 ＊＊ 86.416±4.085 ＊＊
木香烃内酯30 μmol/L浓度组 65.146±3.051 ＊＊ 81.473±3.725 ＊＊ 88.903±2.707 ＊＊
木香烃内酯40 μmol/L浓度组 71.685±5.012 ＊＊ 86.975±1.912 ＊＊ 90.995±2.677 ＊＊
木香烃内酯50 μmol/L浓度组 87.579±2.487 ＊＊ 92.409±1.989 ＊＊ 93.650±2.710 ＊＊
＊＊
＊
注：与空白对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊
Note：vs. blank control group，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
3.2 木香烃内酯对SK-BR-3细胞凋亡的影响
空白对照组细胞轮廓清晰、形态规则、细胞质饱满、
贴壁较好。与空白对照组比较，木香烃内酯 10、20、30
μmol/L浓度组细胞数量明显减少、结构松散、体积缩小、
间隙变大，且多数细胞轮廓消失、皱缩变圆，贴壁不良；
随木香烃内酯浓度的增加，细胞凋亡率显著升高（P＜
0.05 或 P＜0.01）。各组细胞形态学显微图见图 1，细胞
凋亡率测定结果见图2。
A.空白对照组 B.木香烃内酯10 μmol/L浓度组
C.木香烃内酯20 μmol/L浓度组 D.木香烃内酯30 μmol/L浓度组
图1 各组细胞形态学显微图（Hoechst 33258染色，×200）
Fig 1 Morphological micrographs of cells in each
group（Hoechst 33258 staining，×200）
中国药房 2020年第31卷第11期