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2.2 齐墩果酸药液配制                                        Transwell小室上层中，小室下层加入DMEM培养基（含
            精密称取齐墩果酸对照品适量，溶于二甲基亚砜 1                         10％FBS）800 μL，培养 24 h。按“2.4.1”项下方法分组、
        mL 中，配成浓度为 1×10 µmol/L 的母液，于－20 ℃保                  给药，培养24 h后，取出小室，用棉签擦去小室内侧底部
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        存；用时取上述母液适量，加完全培养基稀释，经 0.22                         未穿膜的细胞，经多聚甲醛固定、结晶紫染色液染色后，
        µm微孔滤膜滤过后，即得，备用。                                    在显微镜下选取5个不同视野观察，计算各组细胞迁移
        2.3 细胞毒性检测                                          数目（迁移细胞被染成紫色）。上述试验重复3次。
            采用 CCK-8 法检测。取对数生长期的 SKOV3 细                    2.6  Transwell侵袭实验
        胞，以 4 000 个/孔接种于 96 孔板中，培养 24 h 时将细胞                    Matrigel胶融化后均匀铺于Transwell小室底部上层
        随机分为对照组及不同浓度药物组，另设不含细胞只含                            中，37 ℃放置致凝固。其余操作同“2.5”项下方法，选取
        培养基的空白组，每组设6个复孔。各给药组分别加入                            5 个不同视野在显微镜下观察，计算各组细胞侵袭数
        齐墩果酸终浓度为 10、20、40、60、80、100 μmol/L（浓度               目。上述试验重复3次。
                                                            2.7 相关基因mRNA表达检测
        设置参考文献[19]）的含药完全培养基100 μL，对照组和
                                                                采用实时荧光定量 PCR 法检测。SKOV3 细胞按
        空白组加入完全培养基 100 μL，分别于培养 12、24、36、
                                                           “2.4.1”“2.4.2”项下方法分组、给药、培养后，收集细胞，
        48 h时，加入CCK-8试剂10 μL ，继续培养2 h后，使用酶
                                                            运用 TRIzol TM  RNA 提取试剂提取细胞 RNA，将其逆转
        标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度（A），计算细胞存活
                                                            录为 cDNA 后，采用实时荧光定量 PCR 仪检测 NF-κB
        率：细胞存活率（％）＝（A 试验组－A 空白组）/（A 对照组－A 空白组）×
                                                            p65、PRL-3、TNF-α、IL-6、E-cadherin 等编码基因 mRNA
        100％。上述试验重复3次。
                                                            的表达水平。PCR 反应体系（共 20 µL）：cDNA 模板 2
        2.4  分组、造模与给药
                                                            µL，上、下游引物各 1 µL，荧光定量 PCR 试剂 10 µL，无
        2.4.1  齐墩果酸对 SKOV3 细胞的作用             取 SKOV3 细
                                                            酶水 6 µL。PCR 扩增条件：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变
        胞，以5×10 个/皿接种于细胞培养皿中培养；待细胞生长
                  6
                                                            性 10 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 15 s，共 40 个循环（引
        融合至 80％时，将其随机分为对照组和齐墩果酸低、高
                                                            物序列见表1）。以GAPDH为内参，采用2               －ΔΔCt 法计算相
        剂量药物组（剂量设置参考“2.3”项下结果），每组设3个
                                                            关基因mRNA的相对表达量。上述试验重复3次。
        复孔。药物组分别加入低、高剂量齐墩果酸含药完全培
                                                                             表1   引物序列
        养基5 mL，对照组加入完全培养基5 mL，培养24 h。
                                                                         Tab 1 Primer sequence
        2.4.2  齐墩果酸对 LPS 诱导 SKOV3 细胞的作用               取
                                                            基因名称               引物序列                 产物长度，bp
        SKOV3 细胞，以 5×10 个/皿接种于细胞培养皿中培养；                     GAPDH       正向：5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′  154
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        待细胞生长融合至 80％时，将其随机分为对照组、LPS                                     反向：5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′
                                                            NF-κB p65   正向：5′-GCGAGAGGAGCACAGATACC-3′  120
        模型组和齐墩果酸低、高剂量药物组（剂量设置参考
                                                                        反向：5′-GCACAGCATTCAGGTCGTAG-3′
       “2.3”项下结果），每组设 3 个复孔。对照组加入完全培                        PRL-3       正向：5′-GGGACTTCTCAGGTCGTGTC-3′  130
        养基5 mL，模型组加入LPS终浓度为100 µg/L 的含药完                                反向：5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′
                                                            TNF-α       正向：5′-CCATGTCTTTCTACCCTAATC-3′  98
        全培养基 5 mL ，药物组加入为 100 µg/L LPS 和低、高                             反向：5′-AGCTGCTCTGTCGGATG-3′
                     [20]
        剂量齐墩果酸含药完全培养基5 mL，培养24 h。                           IL-6        正向：5′-AAGCAGAGCTGTGCAGATGAGTA-3′  280
        2.4.3  齐墩果酸对 NF-κB p65 转染的 SKOV3 细胞的作                           反向：5′-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC-3′
                                                            E-cadherin  正向：5′-GAACGCATTGCCACATACAC-3′  120
                                 6
        用   取SKOV3细胞，以5×10 个/皿接种于细胞培养皿中                                 反向：5′-GAATTCGGGC TTGTTGTCAT-3′
        培养；待细胞生长融合至80％时，将其随机分为对照组、                          2.8 相关蛋白表达检测
        NF-κB p65 过表达模型组和齐墩果酸低、高剂量药物组                           采 用 Western blotting 法 检 测 。 SKOV3 细 胞 按
        （剂量设置参考“2.3”项下结果），模型组及药物组加入                        “2.4.1”～“2.4.3”项下方法分组、给药、培养后，收集细
        NF-κB p65 过表达载体（Lipofectamine 2000 转染试剂             胞，运用 M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂提取蛋白，后
                                          TM
                                                                          TM
        10 µL 与 NF-κB p65 质粒 10 µg 于室温下孵育 20 min 即          用BCA试剂盒测定蛋白浓度。随后将蛋白于95 ℃水浴
        得）转染12 h后，药物组分别加入低、高剂量齐墩果酸含                         中变性 5 min 后即得蛋白样品。取蛋白样品 40 µg 在
        药完全培养基5 mL，对照组及模型组给予完全培养基5                          100 V、80 mA 的电泳条件下进行 SDS-PAGE，在 25 V、
        mL，培养24 h。                                          1.0 A条件下转膜至PVDF膜（0.45 µm）上，以5％脱脂牛
        2.5  Transwell迁移实验                                  奶封闭 1 h 后，加入 NF-κB p65、PRL-3、TNF-α、IL-6、
            将 SKOV3 细胞用不含 FBS 的 DMEM 培养基培养                  E-cadherin、β-actin等一抗（稀释度均为1 ∶ 1 000），在4 ℃
        24 h，使其处于饥饿状态。SKOV3细胞经胰蛋白酶消化                        条件下孵育过夜，TBST 溶液清洗 10 min×3 次，加入
                                             5
        后用DMEM培养基制成细胞悬液，以1×10 个/孔加入到                        辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释度

        ·1192  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 10                                中国药房    2020年第31卷第10期
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