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完全，经0.45 μm滤膜滤过，即得。 2.3.2 线性关系考察 精密吸取氨基酸标准溶液 5 份，
2.2 色谱条件 分别加样品稀释液配制成单个氨基酸浓度均为 20、40、
采用氨基酸全自动分析仪进行测定 。色谱柱为 80、120、200 μmol/L 的系列对照溶液，按“2.2”项下色谱
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LCAK06/Na型磺酸基强酸性阳离子交换树脂分离柱；流 条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（y）为纵坐标、氨
动相分别为缓冲液A、缓冲液B、再生液C，梯度洗脱（程 基酸质量浓度（x，单位换算为μg/L）为横坐标，进行线性
序见表 2），流速为 0.45 mL/min；衍生液为茚三酮溶液， 回归，得标准曲线方程，详见表3。结果表明，17种氨基
流速为0.25 mL/min；检测波长为440 nm（Pro）和570 nm 酸在各自质量浓度范围内线性关系均良好（r＞0.998）。
（其余16种氨基酸）；进样量为50 μL。 表3 17种氨基酸回归方程及线性范围
表2 梯度洗脱程序 Tab 3 Regression equation and linear range of 17
Tab 2 Gradient elution program kinds of amino acids
时间， 缓冲液A， 缓冲液B， 再生液C， 时间， 缓冲液A， 缓冲液B， 再生液C， 编号 氨基酸 回归方程 r 线性范围，μg/L
min ％ ％ ％ min ％ ％ ％ 1 Asp y＝2.820×10 x+311.0 0.998 5 2.662～26.62
5
0.0 100 0 0 30.0 0 100 0 2 Thr y＝3.034×10 x +1 003 0.998 3 2.382～23.82
5
1.0 100 0 0 42.0 0 100 0 3 Ser y＝3.659×10 x+621.0 0.998 8 2.102～21.02
5
11.0 85 15 0 42.1 0 0 100 4 Glu y＝2.460×10 x+597.8 0.999 0 2.943～29.43
5
17.0 80 20 0 45.1 0 0 100 5 Gly y＝5.136×10 x+119.2 0.998 7 1.501～15.01
5
23.0 67 33 0 45.2 100 0 0 6 Ala y＝4.300×10 x+387.5 0.998 7 1.782～17.82
5
27.0 20 80 0 58.2 100 0 0 7 Cys y＝1.892×10 x+906.6 0.998 3 4.806～48.06
5
29.0 20 80 0 58.3 100 0 0 8 Val y＝3.365×10 x+176.0 0.998 4 2.343～23.43
5
5
2.3 方法学考察 9 Met y＝2.494×10 x+941.2 0.998 7 2.984～29.84
10 Ile y＝2.890×10 x+381.7 0.998 6 2.623～26.23
5
2.3.1 系统适用性试验 分别精密吸取“2.1”项下混合
11 Leu y＝2.928×10 x+566.4 0.998 6 2.623～26.23
5
对照品溶液、供试品溶液（编号：S7）适量，并以样品稀释 12 Tyr y＝2.012×10 x+605.3 0.998 6 3.624～36.24
5
5
液为空白，按“2.2”项下色谱条件进样测定。结果显示， 13 Phe y＝2.158×10 x+428.1 0.998 9 3.304～33.04
14 His y＝2.340×10 x+1850 0.998 6 3.100～31.00
5
混合对照品溶液和供试品溶液中 17 种氨基酸均分离良
15 Lys y＝2.682×10 x+509.1 0.998 6 2.924～29.24
5
好，空白无干扰，色谱图见图1。 16 Arg y＝1.930×10 x+434.3 0.998 6 3.484～34.84
5
17 Pro y＝6.954×10 x+121.9 0.999 4 2.303～23.03
5
300 2.3.3 精密度试验 取“2.1.2”项下混合对照品溶液，按
200
mV 100 “2.2”项下色谱条件连续进样 6 次，记录峰面积。结果，
U， 17种氨基酸峰面积的RSD为0.08％～1.52％（n＝6），表
0 Ⅱ
Ⅰ
－100 明仪器精密度良好。
0 10 20 30 40
t，min 2.3.4 重复性试验 精密称取同一样品（编号：S7）5份，
A.混合对照品溶液 每份0.5 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”
500
项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算含
400
mV 300 量。结果，17 种氨基酸含量的 RSD 为 0.50％～1.98％
U， 200 （n＝5），表明本方法重复性良好。
100
Ⅱ
0 Ⅰ 2.3.5 稳定性试验 取“2.1.3”项下同一供试品溶液（编
0 10 20 30 40 号：S7），分别于室温下放置 0、2、4、6、8、10、12、16、20、
t，min
B.供试品溶液（编号：S7） 24 h时按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结
果，17 种氨基酸峰面积的 RSD 为 0.80％～1.51％（n＝
300
10），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。
200
mV 100 Ⅱ 2.3.6 加样回收率试验 精密称取已测得含量的样品
U， Ⅰ
0 （编号：S7）6份，每份0.5 g，精密加入“2.1.2”项下混合对
－100 照品溶液 1 mL，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，
0 10 20 30 40
t，min 再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加
C.样品稀释液
样回收率，详见表4。结果表明，该方法准确度良好。
注：Ⅰ.检测波长570 nm；Ⅱ.检测波长440 nm
2.4 样品含量测定
Note：Ⅰ. detection wavelength of 570 nm；Ⅱ. detection wave-
length of 440 nm 取 18 批样品（S1～S18），按“2.1.3”项下方法制备供
图1 系统适用性高效液相色谱图 试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以外标法计
Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability 算含量。各样品平行测定3次，取平均值，结果见表5。
·470 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 4 中国药房 2020年第31卷第4期