Page 28 - 2019年10月第30卷第20期
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毛蚓[Pheretima aspergillum（E. Perrier）]的干燥体、伞形 间隙注入等容生理盐水，其余操作同上。术后，所有大
科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根茎、 鼠均自由饮水、进食。自造模后第2天起，正常组和模型
蔷薇科植物桃[Amygdalus persica（L.）]的干燥成熟种子、 组大鼠均灌胃水[10 mL/（kg·d）]，地塞米松组大鼠灌胃
菊科植物红花（Chelonopsis tinctorius L.）的干燥花。 地塞米松 0.405 mg/（kg·d）（以水为溶剂，剂量设置参考
醋酸地塞米松片（阳性对照，浙江仙琚制药股份有 人等效剂量并按动物体表面积换算而得），补阳还五汤
限公司，批号：151238，规格：0.75 mg）；注射用盐酸博来 低、中、高剂量组分别灌胃补阳还五汤 6.435、12.87、
霉素（瀚晖制药有限公司，批号：16032311，规格：1.5 万 25.74 g/（kg·d）（以生药总质量计，由“2.1”项下药液经水
单位）；兔源α-SMA 抗体（批号：AG02247616）、兔源 稀释制得；剂量设置参考人等效剂量并按动物体表面积
VE-cadherin 抗体（批号：AC03185478）、兔源 CD31 抗体 换算而得，其中中剂量与人等效剂量相当，每日1次，连
（批号：AO04265948）、兔源FSP1抗体（批号：AC09223656） 续28 d。
均购自北京博奥森生物技术有限公司；兔源 Notch4 抗 2.3 标本采集
体（批 号 ：GR288351-4）、山 羊 源 DLL4 抗 体（批 号 ： 末次给药 24 h 后，大鼠腹腔注射 10％水合氯醛（3
GR162316-12）均购自英国 Abcam 公司；山羊抗兔辣根 mL/kg）麻醉，于其股动脉放血后剖取两肺，剪除气管、支
过氧化酶（HRP）标记二抗（批号：3825j63）、兔抗山羊 气管，取左肺组织适量，备用。
HRP标记二抗（批号：34q9532）、山羊抗小鼠HRP标记二 2.4 肺组织中内皮细胞、间质细胞标志物表达情况检测
抗（批号：1292k61）、小鼠源β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批 采用免疫组化法检测。取“2.3”项下大鼠肺组织
号：48k2671）均购自美国Affinity Biosciences公司；RIPA 适量，用－20 ℃氯化钠溶液清洗3次，滤纸吸干水分，于
裂 解 液 、十 二 烷 基 硫 酸 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 4％多聚甲醛溶液中固定 48 h 后，常规石蜡包埋、切片
（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液均购自碧云天生物技术有 （厚度约为5 μm），置于60 ℃干燥箱中烘干2 h。切片经
限公司；0.01 mol/L 柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）、牛血清白 二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水后，用3％H2O2溶液室温孵育
蛋白、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自北京索莱 10～15 min，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）清洗5 min×3
宝科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自美国 Ther- 次后，置于 0.01 mol/L 柠檬酸钠缓冲液中，95 ℃微波加
mo Fisher Scientific 公 司 ；ECL 发 光 液 、聚 偏 氟 乙 烯 热 10 min，进行抗原热修复；冷却至室温，用 PBS 清洗 5
（PVDF）膜均购自默克密理博（中国）有限公司；其余试 min×3 次，用牛血清白蛋白于 37 ℃封闭 30 min；分别滴
剂均为分析纯，水为纯化水。 加 CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP-1 一抗（稀释度均为
1.3 动物 1∶200），于37 ℃孵育2 h；用PBS清洗5 min×3次，滴加山
SPF 级健康 SD 大鼠 48 只，雄性，2 月龄，体质量 羊抗兔HRP标记二抗（稀释度为1 ∶ 1 000），室温孵育 30
180～200 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物生 min；用 PBS 清洗 5 min×3 次，经 DAB 显色试剂盒显色
产合格证号：SCXK（湘）2014-0011。 后，行常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、树胶封片；在光
2 方法 学显微镜高倍镜视野（×200）下随机选取5个视野观察，
2.1 补阳还五汤药液的制备 采用 Image Pro Plus 6.0 软件测量并记录每个视野中阳
按补阳还五汤的配方比例（生黄芪 120 g、当归 6 g、 性染色（即染色后呈棕黄色的细胞）的平均光密度值，以
赤芍5 g、地龙3 g、川芎3 g、桃仁3 g、红花3 g）称取各饮 此表示相应蛋白的表达水平。
片适量，用 10 倍量（mL/g）水浸泡 30 min 后，文火煎煮 2 2.5 肺组织中Notch4、DLL4表达情况检测
次，每次1 h，合并滤液，减压浓缩，分别制得质量浓度分 采用蛋白质印迹法检测。取“2.3”项下大鼠肺组织
别为 1.5、3、6 g/mL（以生药总质量计）的药液，于 4 ℃保 100 mg，加入 4 ℃预冷的 RIPA 裂解液 1 mL，匀浆，于
存，备用。 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 20 min，收集上清液。采用
2.2 分组、造模与给药 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，加入等体积 2×
所有大鼠均适应性喂养7 d后，随机分为正常组、模型 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液后，于 95 ℃水浴中变性 5
组、地塞米松组和补阳还五汤低、中、高剂量组，每组 8 min 后，于－80 ℃保存，备测。取上述蛋白适量进行
只。除正常组外，其余各组大鼠均于气管内注射博来霉素 SDS-PAGE 电泳（电压：100 V，时间：1.5 h），电泳结束后
以复制IPF模型：大鼠腹腔注射10％水合氯醛（3 mL/kg） 转移至PVDF膜后，于5％脱脂奶粉中室温振摇封闭1 h；
麻醉后，行颈正中切口，分离、暴露气管，经气管软骨环 分别加入 Notch4、DLL4、β-actin 一抗（稀释度分别为
间隙向心端穿刺，注射博来霉素0.5万单位/kg（以生理盐 1∶1 000、1∶2 500、1∶5 000），4 ℃孵育过夜，用TBST溶液
水为溶剂），随后立即将大鼠直立并旋转，使药液在肺内 清洗 8 min×3 次，分别滴加山羊抗兔 HRP；标记二抗、兔
分布充分、均匀，缝合伤口。正常组大鼠经气管软骨环 抗山羊HRP标记二抗、山羊抗小鼠HRP标记二抗（稀释
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