Page 33 - 2019年9月第30卷第18期
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液（即吸出原培养基 5 mL，再加入新培养基 5 mL）。于                      剂盒说明书操作，采用流式细胞仪检测存活 DC 细胞的
        培养的第7天收集细胞，加入Biotin-CD11c染色，结合链                     比例（即 7AAD/PE-Annexin Ⅴ双阴性活细胞的比例）。
        霉亲和素微球后，借助磁珠分选系统筛选、纯化后得到                            上述试验重复 3 次，数据采用 NovoExpress 1.3.0 软件
        CD11c 阳性 imDC（CD11c+imDC）（经流式细胞仪检测                  分析。
        CD11c 阳性细胞比例超过 95％）。将上述经纯化的                         2.5 DC培养液中炎症细胞因子水平检测
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        CD11c+imDC重悬于完全培养基中，以1×10 个/mL的密                        采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测。取“2.1”
                                                                                                 6
        度按1 mL/孔重新接种于24孔板中，用最终质量浓度为                         项下经纯化的 CD11c+imDC 适量，以 1×10 个/mL 的密
        0.1 μg/mL的LPS刺激24 h后，即得成熟DC（成熟DC在                   度按 1 mL/孔接种于 24 孔板中，按“2.3”项下方法分组、
        显微镜下呈现树突样特征，且经流式细胞仪检测其                              给药，培养6 h后，各组均加入最终质量浓度为0.1 μg/mL
        MHCⅡ、CD80、CD86呈高表达）。                                的LPS刺激24 h。收集细胞培养液，参照相关试剂盒说
        2.2 DC特异性表面分子检测                                     明书，采用ELISA法以全自动酶标仪检测各组细胞培养
            采 用 流 式 细 胞 术 检 测 。 取“2.1”项 下 经 纯 化 的           液中IL-10、IL-12、TNF-α水平。上述试验重复3次。
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        CD11c+imDC 适量，以 1×10 个/mL 的密度按 1 mL/孔接              2.6 统计学方法
        种于24孔板中，将细胞随机分为imDC组、空载组、阳性                             采用 Graphpad Prism 6.0 软件对数据进行统计分
                                                 [14]
        组（托法替尼，1 μmol/L；剂量设置参考既往研究 ，为最                      析。计量资料均以x±s表示，组间比较采用Dunnett’s t
        大安全、有效剂量）以及 PO-296 低、中、高剂量组（1、5、                    检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
        25 μmol/L；剂量设置参考本课题组前期预试验结果），每                      3 结果
        组设 3 个复孔。吸弃上清液，imDC 组和空载组加入完                        3.1 PO-296对DC特异性表面分子表达的影响
        全培养基1 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基                              与imDC组比较，空载组MHC Ⅱ、CD80、CD86阳性
        1 mL。培养6 h后，除imDC组外，其余各组均加入最终                       细 胞 比 例 均 显 著 升 高 ，差 异 均 有 统 计 学 意 义（P＜
        质量浓度为 0.1 μg/mL 的 LPS 刺激 24 h。收集细胞，以                0.05）。与空载组比较，阳性组以及PO-296中、高剂量组
        300×g 离心 5 min 后，弃去上清液，沉淀用 4 ℃预冷的                   MHC Ⅱ、CD80、CD86 阳性细胞比例均显著降低，差异
        PBS 1 mL 清洗，以 300×g 离心 5 min，沉淀分别加入 BV              均有统计学意义（P＜0.05）；而空载组CCR7阳性细胞比
        421-MHC Ⅱ 、FITC-CD80、PE-CD86、Alexa Fluor            例与 imDC 组比较，PO-296 低剂量组 MHC Ⅱ、CD80、
        647-CCR7 适量，于 4 ℃避光孵育 30 min，用 4 ℃预冷的               CD86 阳性细胞比例以及各给药组 CCR7 阳性细胞比例
        PBS 1 mL清洗，以300×g离心5 min，弃去上清液。细胞                   与空载组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），详见图
        用 PBS 200 μL 重悬后，使用流式细胞仪检测 MHC Ⅱ、                   2、表1。
        CD80、CD86 和 CCR7 阳性细胞比例。上述试验重复 3                    3.2  PO-296对imDC吞噬功能及DC存活情况的影响
        次，数据采用NovoExpress 1.3.0软件分析。                            各给药组葡聚糖阳性细胞比例以及存活细胞比例
        2.3  imDC吞噬功能检测                                     与空载组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），详见图
            采 用 流 式 细 胞 术 检 测 。 取“2.1”项 下 经 纯 化 的           3、表2。
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        CD11c+imDC 适量，以 1×10 个/mL 的密度按 1 mL/孔接              3.3  PO-296对DC炎症细胞因子水平的影响
        种于 24 孔板中，将细胞随机分为空载组、阳性组以及                              与空载组比较，PO-296 各剂量组细胞培养液中
        PO-296低、中、高剂量组（剂量设置同“2.2”项），每组设3                    IL-10 水平均显著升高，各给药组细胞培养液中 IL-12、
        个复孔。吸弃上清液，空载组加入完全培养基1 mL，各                          TNF-α水平均显著降低，差异均有统计学意义（P＜
        给药组加入含相应药物的完全培养基 1 mL。培养 48 h                       0.05），详见表3。
        后，各组均加入FITC-葡聚糖适量（使后者最终质量浓度                         4 讨论
        为1 mg/mL），孵育60 min，经4 ℃预冷的PBS清洗后，采                      近年来，随着细胞免疫治疗在感染性疾病、自身免
        用流式细胞仪检测 imDC 的抗原摄取能力（即其吞噬功                         疫性疾病、肿瘤等领域的快速发展，DC已逐渐成为过继
        能，以葡聚糖阳性细胞比例表示）。上述试验重复3次，                           转移治疗研究的热点。因自身免疫性疾病相关的自身
        数据采用NovoExpress 1.3.0软件分析。                          抗原尚不明确，在临床试验中DCreg不能负载有效的自
        2.4 DC存活情况检测                                        身抗原，从而诱导自身抗原特异性 T 细胞耐受，因此无
            采 用 流 式 细 胞 术 检 测 。 取“2.1”项 下 经 纯 化 的           法重复 DCreg 对动物疾病模型的干预效果               [4，15] 。而新近
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        CD11c+imDC 适量，以 1×10 个/mL 的密度按 1 mL/孔接              发现和鉴定的自身抗原（如寻常性天疱疮相关的Desmo-
        种于 24 孔板中，按“2.3”项下方法分组、给药，培养 6 h                    glein-3；多发性硬化相关的 B-crystallin、Anoctamin 2 和
        后，各组均加入最终质量浓度为 0.1 μg/mL 的 LPS 刺激                   KIR4.1等）为DCreg过继转移治疗自身免疫性疾病带来
        48 h。收集细胞，按照7AAD/PE-Annexin Ⅴ凋亡检测试                  了新的希望     [16-17] 。继往获取DCreg的主要手段包括免疫


        ·2476  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 18                                中国药房    2019年第30卷第18期
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