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树突状细胞（Dendritic cell，DC）作为机体内功能最                                  OH
        强的抗原呈递细胞，在表型和功能上均具有较强的可塑                                                     O           Cl
        性，可直接活化幼稚T细胞，在诱导T细胞免疫应答或免                                              N
                                                                             N       N
        疫耐受的过程中发挥了十分重要的作用                  [1-2] 。有研究指
        出，DC表型、成熟度及功能的异质性是免疫反应平衡和                                        图1 PO-296的结构式
        免疫耐受的重要因素，其中成熟 DC 可表达高水平的共                                     Fig 1 Structure of PO-296
        刺激分子，分泌T细胞刺激因子[如白细胞介素6（IL-6）、                      限公司]；PowerWave XS 型全波长酶标仪（美国 BioTek
        IL-12、IL-15、IL-18 等]，选择性激活相应受者的 T 细胞，              公司）；371型CO2培养箱、Sorvall型台式高速离心机（美
        从而诱发免疫反应；而未成熟DC（imDC）则可表达低水                        国 Thermo Fisher Scientific 公司）；IX71 型倒置显微镜
                                                                                        TM
        平的共刺激分子，通过诱导 T 细胞无能、免疫偏离、T 细                       （日本Olympus公司）；Mini MACS 型磁珠分选系统（德
        胞凋亡或者调节性 T 细胞（Treg 细胞）产生等途径而形                      国 Miltenyi 公司）；5424R 型小型高速离心机（德国 Ep-
                  [3]
        成免疫耐受 。药物诱导的调节性树突状细胞（DCreg）                        pendorf公司）。
        更为稳定，不会因脂多糖（LPS）等抗原刺激而分化成熟，                        1.2 药品与试剂
        其经典表型和功能与 imDC 相似，可正常表达 DC 特征                          PO-296 原料药（地奥集团成都药业股份有限公司，
        性抗原CD11c，而低水平表达共刺激分子；同时，其炎症                        批号：1711012-296，纯度：≥98％）；托法替尼对照品（阳
        细胞因子IL-12、肿瘤坏死因子α（TNF-α）分泌水平降低，                    性对照，美国Sigma公司，批号：PZ0017，纯度：≥98％）；
        抗炎细胞因子 IL-10 分泌水平升高             [4-5] 。如，干扰素β      重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、
       （IFN-β）可干预体外培养的imDC分化成熟，抑制或减少                       重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）（美国Peprotech公司，批
        其IL-12、干扰素γ（IFN-γ）的分泌，进而对辅助性T细胞1                   号分别为315-03、214-14）；LPS、异硫氰酸荧光素（FITC）-
        型（Th1）的极化起到负向调控作用；同时，IFN-β可刺激                      葡聚糖（美国Sigma公司，批号分别为L4516、53379）；链
        Treg细胞的增殖，该作用也是其对多发性硬化症有效的                         霉亲和素微球（德国 Miltenyi 公司，批号：130-048-102）；
        原因之一 。目前，国内外研究团队以过继转移自身抗                           荧光素标记的大鼠抗小鼠流式检测抗体 Brilliant violet
                [6]
        原负载的DCreg干预胶原诱导的关节炎、实验性自身免                         421-MHCⅡ（BV 421-MHCⅡ）、FITC- CD80、藻红蛋白
        疫性脑脊髓炎以及炎性肠病等自身免疫性疾病动物模                            （PE）-CD86、Alexa Fluor 647-CCR7 以及红细胞裂解液
        型为对象进行相关研究，发现DCreg可明显减轻上述模型                        （美 国 BioLegend 公 司 ，批 号 分 别 为 107632、561954、
        动物体内炎症细胞浸润程度以及炎症活动度                  [7-10] 。由于干   553692、560766、420301）；生物素（Biotin）-CD11c染色试
        预自身免疫性疾病动物模型所需DCreg的用量较大（约                         剂、IL-10试剂盒、7-氨基放线菌素（7AAD）/PE-膜联蛋白
        为1×10 个/只） ，因此建立获取大量DCreg的有效方法                     Ⅴ（Annexin Ⅴ）凋亡检测试剂盒（美国 BD Pharmingen
                     [11]
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        无疑是其临床应用的重要前提和基础。本课题组前期                            公司，批号分别为117303、555157、559763）；IL-6、TNF-α
        通过对一系列小分子化合物的高通量筛选发现，苯并噁                           试剂盒（美国 eBioscience 公司，批号分别为 BMS603-2、
        唑衍生物2-（氯苯并噁唑基-2基）-4，5，6，7-四氢-二氢-吲                  BMS607-3）；RPMI 1640 培养基（美国 HyClone 公司，批
        唑-3-醇（PO-296，结构式见图1）可经Janus激酶3/信号转                 号：SH30809.01）；胎牛血清（澳大利亚Bovogen公司，批
        导及转录激活因子5（Jak3/Stat5）信号通路显著抑制活化                    号：50615）；其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。
        的人T细胞增殖 。而近期研究发现，Jak3是DC成熟分                        1.3  动物
                      [12]
        化的关键调控因子，该因子缺陷的 DC 将无法在混合淋                             SPF级C57BL/6小鼠，雄性，6～8周龄，体质量21～
        巴细胞反应中有效刺激抗原特异性 T 细胞的增殖                    [13-14] 。  23 g，由成都医学院SPF实验动物中心提供，动物使用许
        因此，本研究拟初步探讨 PO-296 是否可经 Jak3/Stat5 信               可证号：SYXK（川）2015-196。
        号通路调控 DC 成熟分化、诱导 DCreg 的产生；同时，建                    2 方法
        立骨髓来源的 DC 体外诱导模型，在予以不同剂量的                          2.1 DC分离与培养
        PO-296 预处理后，检测其特异性表面分子[Ⅱ类主要组                           取雄性 C57BL/6 小鼠，以脱臼法处死，分离其双侧
        织相容性复合物（MHC Ⅱ）、CD80、CD86、趋化因子受                     股骨，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）反复吹打，制得骨
        体7（CCR7）]以及炎症细胞因子（IL-12、IL-10、TNF-α）的              髓细胞悬液，经200目筛网滤过后，以300×g离心5 min，
        表达水平，以期为后续PO-296诱导DCreg对自身免疫疾                      弃去上清液，沉淀用红细胞裂解液裂解，计数后用含
        病动物模型的体内干预研究提供更为完善和可靠的实                            10％胎牛血清、20 ng/mL rmGM-CSF、10 ng/mL rmIL-4
        验依据。                                               的RPMI 1640培养基（以下简称“完全培养基”）重悬，调
        1 材料                                               整细胞密度至1×10 个/mL，接种于100 mm平皿（接种体
                                                                            6
        1.1  仪器                                            积：10 mL）内，置于 37 ℃、5％CO2 培养箱（下同）中培
            ACEA NovoCyte型流式细胞仪[艾森生物（杭州）有                  养。于培养的第3、5天使用上述完全培养基进行半量换


        中国药房    2019年第30卷第18期                                            China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 18  ·2475  ·
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