Page 94 - 2019年8月第30卷第16期
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仪（上海亚荣生化仪器厂）；WH-2型微型旋涡混合仪（上                        内的乳兔，于无菌条件下剥离其后肢胫骨和股骨，置于
        海沪西分析仪器厂有限公司）；KH-500DE型数控超声波                       4 ℃磷酸盐缓冲液（PBS，pH为7.2～7.3）中，去除骨周围
        清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。                                 的软组织，将骨干置于破骨细胞α-MEM完全培养基（即
        1.2 药材、药品与试剂                                       含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素双抗、1％谷氨酰胺
            女贞子饮片（酒制，贵州同济堂中药饮片有限公司，                        的破骨细胞α-MEM培养基，下同）中，纵向剖开骨干，用
        批号：110502）经贵州大学生命科学学院熊源新教授鉴                        无菌刀片轻刮其内表面至颜色变白；将完全培养基及骨
                                                                                                      6
        定为木犀科植物女贞（L. lucidum Ait.）的干燥成熟果实。                 渣涡旋振荡，过 200 目筛后制成细胞悬液，以 1×10 ～2×
                                                             6
            破骨细胞α-MEM 培养基、成骨细胞α-MEM 培养基                    10 个/孔的密度接种至24孔板（可根据试验需要预先放
       （美国 Gibco 公司，批号分别为 1148795、1510464）；甲苯              置骨磨片）中，于 37 ℃、5％CO2 培养箱（下同）中培养
        胺蓝染色液（批号：BCBG4799V）、胎牛血清（批号：                       24 h；用PBS洗掉未贴壁的细胞，再加入含1×10               －8  mol/L
        140502）、L-抗坏血酸（批号：A7506）、β-甘油磷酸钠（批                 1α，25-（OH） 2VitD3的完全培养基中进行诱导，记为培养
        号：G5422）、地塞米松对照品（批号：D1756，纯度：≥                     的第1天，之后每隔3天更换1次培养基，并采用自然沉
        98％）均购自美国 Sigma 公司；青霉素/链霉素双抗（批                     降法 筛选出骨髓细胞（即形态统一，且呈梭状分布者）。
                                                               [9]
        号：20140718）、MTT试剂（批号：46170204106）均购自北              2.3 女贞子提取物对破骨细胞分化的影响
        京索莱宝科技有限公司；谷氨酰胺对照品（中国食品药                               采用TRACP活性测定法检测。取“2.2”项下对数生
                                                                                     3
        品检定研究院，批号：100968-201001，纯度：100％）；1α，               长期的骨髓细胞适量，按5×10 个/孔的密度接种于96孔
        25-（OH） 2VitD3 对 照 品（批 号 ：096M4039V，纯 度 ：≥         板（勿需骨磨片）中，培养24 h。将细胞随机分为空白对
        98％）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）测试盒及其染色                       照组，女贞子醇提物低、中、高剂量组（2、20、200 mg/L，按
        试剂盒（批号分别为 20140805、SLBJ7300V）、碱性磷酸                 醇提物质量计，以 DMSO 为溶剂；剂量设置参考前期预
        酶（AKP）测试盒（批号：20150809）均购自日本 Sigma 公                试验结果，下同），女贞子水煎物低、中、高剂量组（2、20、
        司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量测定试剂盒（批号：                          200 mg/L，以水煎物质量计，以DMSO为溶剂；剂量设置
        20140803）、Tritonx-100 裂解液（批号：M2528）均购自美            参考前期预试验结果，下同），每组设置6个复孔。吸弃上
                                                                                    －8
        国MP Biomedicals公司；4％中性甲醛溶液（南京建成生                   清液，空白对照组加入含1×10 mol/L 1α，25-（OH） 2VitD3
        物工程研究所，批号：20160115）；胰酶（美国Amresco公                  的破骨细胞α-MEM完全培养基100 μL，各给药组加入含
        司，批号：1812C306）；其余试剂均为分析纯，水为自制纯                     相应药物和1×10 mol/L 1α，25-（OH） 2VitD3的破骨细胞
                                                                          －8
        化水。                                                α-MEM 完全培养基 100 μL，继续培养。于培养的第 8
        1.3  动物                                            天，使用0.2％TritonX-100裂解液裂解各孔细胞30 min，
            出生 48 h 内的清洁级新西兰乳兔，雌雄不限，体质                     取裂解液 20 μL，按 TRACP 测试盒说明书处理后，使用
        量（120±10）g，由贵阳经济技术开发区鹏程农业科技有                       酶标仪于530 nm波长处检测各孔的吸光度（A）值，并参
        限公司提供，动物生产合格证号：SCXK（黔）2012-001。                    照测试盒说明书方法换算 TRACP 活性[每升裂解液与
        1.4  骨磨片与细胞                                        测试盒底物于37 ℃反应1 min产生1 μmol游离酚即为1
            骨磨片（批号：20161015）由兰州军区兰州总医院骨                    个活力单位（U/L）]。同时，将细胞以PBS清洗后，于4％
        科研究所提供；MC3T3-E1Subclone 14 细胞由中国科学                 中性甲醇溶液中固定 1 min，再用水清洗，轻轻甩干后，
        院细胞库提供。                                            参照 TRACP 染色试剂盒说明书进行染色，使用显微镜
        2 方法                                               进行观察，记录TRACP阳性细胞数（阳性细胞的胞浆呈
        2.1 女贞子提取物的制备                                      红色）。上述试验重复3次。
            称取女贞子饮片100 g，用75％乙醇加热回流提取3                     2.4 女贞子提取物对破骨细胞骨吸收功能的影响
        次（1 000 mL/次），每次 3 h，抽滤，合并滤液，旋转蒸发，                     采用甲苯胺蓝染色法检测。按“2.3”项下方法分组、
        所得浸膏经冷冻干燥后，即得女贞子醇提物样品（15.23                        给药、培养（需骨磨片），每隔2天更换1次培养基。于培
        g，提取率为15.23％）。另称取女贞子饮片100 g，用水煎                    养的第 8 天，弃去培养基，将骨磨片用 PBS 清洗后，于
        煮 3 次（1 000 mL/次），每次分别煎煮 2.5、2、1.5 h，抽滤，           10％中性甲醛溶液中固定 10 min，再用 0.25 mol/L 氨水
        合并滤液，旋转蒸发，所得浸膏经冷冻干燥后，即得女贞                          超声（功率：500 W，频率：40 kHz）清洗 3 次，每次 5 min；
        子水煎物样品（23.83 g，提取率为 23.83％）。上述提取                   经乙醇梯度脱水后，用 1％甲苯胺蓝染色，再用水清洗，
        物均置于4 ℃冰箱中保存，备用。                                   自然晾干；使用显微镜进行观察，采用Image Pro Plus 6.0
        2.2  骨髓细胞的分离与诱导培养                                  软件统计骨吸收陷窝（镜下呈紫红色）数量和骨陷窝面
                        [8]
            参照文献方法 分离骨髓细胞：脱颈处死出生 48 h                      积百分率[骨陷窝面积百分率（％）＝骨陷窝面积/整张骨

        中国药房    2019年第30卷第16期                                            China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 16  ·2249  ·
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