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定）；在第7孔中加入质量浓度为0.4 mg/mL的庆大霉素 工作台上，在无菌条件下切开其腹腔，剪去与脾脏相连
药液（生理盐水配制）10 μL，作为阳性对照组；然后在每 的组织，取下脾脏，用钝头镊子在灭菌后的200目钢丝网
行的第 1～8 孔中均分别加入“1.3”项下 11 种菌株（其中 上磨碎，用无菌 PBS 2 mL 冲洗。将含脾脏细胞的 PBS
大肠埃希菌有 2 种来源菌株）的菌液（1×10 CFU/mL，均 冲洗液以 800 r/min 离心 10 min；弃去上清液，向离心管
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以液体细菌培养基配制）10 μL，第8孔作为阴性对照组； 中加入红细胞裂解液 200 μL，于冰上放置 13 min，以涡
同时设置不含菌、只加入液体细菌培养基的空白对照 旋震荡仪轻轻涡旋2次，再以800 r/min离心5 min；弃去
组。将 96 孔板在 37 ℃条件下培养 24 h，观察细菌的生 上清液，加入红细胞裂解液 100 μL，再以 800 r/min 离心
长状况。每种细菌的每个浓度均设置3个复孔。 5 min；弃去上清液，将细胞以10％RPMI 1640 细胞培养
2.2 安儿宁颗粒的体外抗炎活性试验 基重悬，计数并稀释至密度为1.5×10 个/mL，备用。
6
2.2.1 安儿宁颗粒对巨噬细胞增殖的影响 参照文献 2.3.2 安儿宁颗粒对小鼠淋巴细胞的影响 取“2.3.1”
[9-10]方法进行试验。取生长状态良好的RAW 264.7细 项下的脾脏淋巴细胞重悬液，用10％RPMI 1640 细胞培
胞，用 10％ RPMI 1640 细胞培养基调整密度至 1×10 5 养液稀释至密度为1.0×10 个/mL，按每孔100 μL加入96
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个/mL，按每孔 100 μL 加入 96 孔板，然后每孔加入质量 孔板，按“2.2.1”项下方法设置安儿宁颗粒不同给药剂量
浓度为 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL 的安儿 组并加入相应药液；同时设置加入等体积 2％ RPMI
宁颗粒药液（取“1.2”项下不含蔗糖的安儿宁颗粒样品，
1640维持液的空白对照组。将96孔板在37 ℃、5％CO2
以2％RPMI 1640维持液配制）100 μL，作为不同给药剂
的条件下培养44 h后，按“2.2.1”项下“每孔加入5 mg/mL
量组（剂量根据文献[9-10]方法和预试验结果制定）；同
的 MTT 溶液（以 PBS 配制）……用以表示存活细胞数”
时设置加入等体积 2％ RPMI 1640 维持液的空白对照
步骤同法操作。每组均设置3个复孔。
组。将 96 孔板在 37 ℃、5％CO2的条件下培养 48 h 后，
2.4 统计学方法
每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液（以 PBS 配制）20 μL，继
采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
续按上述条件培养 4 h；弃去上清液，每孔加 DMSO 150
料以x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有
μL，于37 ℃条件下采用酶标仪震荡10 min后，在492 nm
统计学意义。
波长处测定各孔光密度（OD）值，用以表示存活细胞
3 结果
数。每组均设置3个复孔。
3.1 安儿宁颗粒的体外抗菌活性
2.2.2 安儿宁颗粒对 LPS 诱导巨噬细胞释放一氧化氮
肉眼观察结果显示，阴性对照组孔培养基浑浊、细
（NO）的影响 参照文献[11]方法进行试验。取生长状
菌生长良好，阳性对照组孔培养基澄清、细菌生长不明
态良好的RAW 264.7细胞，按“2.2.1”项下方法设置安儿
显，空白对照组孔培养基澄清、细菌生长不明显，提示安
宁颗粒20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 mg/mL
儿宁颗粒对 11 种细菌均有抑制作用。安儿宁颗粒对伤
剂量组并加入相应药液；另设空白对照组和 LPS 模型
寒沙门菌和大肠埃希菌（临床分离菌株）的最低抑菌浓
组，均分别加入等体积2％ RPMI 1640维持液；除空白对
度（MIC）为 50 mg/mL，对粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌的
照组外，各给药剂量组和LPS模型组细胞均加入LPS溶
液（以生理盐水配制，终质量浓度均为 2 μg/mL）。将 96 MIC 为 25 mg/mL，对变形杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃
孔板在 37 ℃、5％CO2 的条件下培养 48 h 后，以 Griess 希菌（标准菌株）、肺炎克雷伯菌和枯草芽孢杆菌的MIC
[12]
法 测定上清液 OD 值。以 OD 值为横坐标（x）、细胞中 为12.5 mg/mL，对表皮葡萄球菌和肺炎链球菌的MIC为
的亚硝酸根离子含量（NO2 ）为纵坐标（y），得标准曲线 6.25 mg/mL。安儿宁颗粒的体外抑菌活性检测结果见
－
方程为 y＝45.685x +115.82x－5.112 8（r＝0.999 8）。按 表1。
2
标准曲线法计算各组细胞上清液中 NO2 的含量，用以 3.2 安儿宁颗粒的体外抗炎活性
－
间接表示细胞释放的NO含量。按公式计算NO释放抑 3.2.1 安儿宁颗粒对 RAW 264.7 细胞增殖的影响 与
制率：抑制率（％）＝[1－（给药组NO含量－空白对照组 空白对照组比较，安儿宁颗粒0.312 5、1.25 mg/mL剂量组
NO 含量）/（模型组 NO 含量－空白对照组 NO 含量）]× 细胞OD值未明显降低，表明此剂量对细胞无毒性；0.625
100％。每组均设置3个复孔。 mg/mL剂量组 OD 值有一定升高，表明此剂量有促进细
2.3 安儿宁颗粒的体外免疫活性试验 胞增殖的趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。安
参照文献[13]方法进行试验。 儿宁颗粒对RAW 264.7细胞增殖的影响考察结果见表2
2.3.1 小鼠淋巴细胞的制备 取 BALB/c 小鼠，断颈脱 （注：当安儿宁颗粒剂量≥2.5 mg/mL时，药液颜色较深，
臼处死后放入 75％乙醇中浸泡 2～3 min 后转移至超净 干扰试验结果，略去）。
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