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2 方法                                               后，随机分为假手术组、模型组和EGCG组（5 mg/g，以生
        2.1 细胞试验                                           理盐水为溶剂；剂量参照前期预试验结果），每组15只。
        2.1.1  细胞模型构建       采用TBHP处理H9C2心肌细胞               假手术组和模型组小鼠均灌胃等体积生理盐水，EGCG
        构建心肌缺血再灌注损伤细胞模型：将细胞接种于含                            组小鼠灌胃相应药物，每日1次，连续7 d。末次给药12
        10％胎牛血清的DMEM高糖培养基（以下简称“完全培                         h 后，采用前降支结扎法复制心肌缺血再灌注损伤小鼠
        养基”）中，置于 37 ℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培                     模型：小鼠吸入异氟烷（3 mL/kg）进行麻醉，以仰卧位固
        养（培养条件下同）。取对数生长期的细胞适量，用                            定，切开气管，连接小动物呼吸机辅助呼吸（呼吸频率：
        0.25％胰蛋白酶消化后，以 800 r/min离心 5 min，收集细               80次/min，潮气量：100 mL，呼吸时间比：1 ∶ 1）。采用7/0
        胞，用DMEM高糖培养基重悬，以5×10 个/mL的密度按                      号缝合线于小鼠左侧第4肋间入胸，并以滑结结扎冠状
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        2 mL/孔接种至 6 孔板中，培养 48 h。吸弃上清液，用磷                   动脉左前降支，造成缺血30 min；然后解开滑结，恢复再
        酸盐缓冲液（PBS，pH 为 7.2～7.4）洗涤 2 次后，加入 100              灌注 4 h，建立心肌缺血再灌注损伤模型。假手术组用
        μmol/L TBHP 溶液（以完全培养基为溶剂，剂量根据本                     7/0缝合线穿过左前降支而不结扎，其余操作同上。
        研究前期预试验确定）500 μL，培养12 h，造成缺氧；随后                    2.2.2  心肌梗死面积检测          采用伊文思蓝和 TTC 双染
        换用完全培养基，继续培养，进行再灌注。                                色法检测。取各组小鼠 6 只，于下腔静脉注射 2％伊文
        2.1.2  细胞存活率检测        采用 MTS 法检测。取对数生              思蓝染色试剂 0.2 mL 后，脱颈处死，剖开胸腔，暴露心
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        长期的细胞适量，以 2.5×10 个/mL 的密度按 200 μL/孔                脏，当心脏右侧变蓝时，迅速取出心脏，用生理盐水冲
        接种至 96 孔板中，培养 48 h。将细胞随机分为对照                       洗，置于－20 ℃冷冻保存。制备厚约1 mm的心脏切片
        组、模型组和 EGCG 不同剂量组（参照本课题组前期预                        5片，置于1％TTC染料中，于37 ℃孵育20 min。用相机
        试验结果，剂量分别为 3.125、6.25、12.5、25、50、100、              拍照后，采用 Image J 1.52 软件分析[伊文思蓝染色的非
        200 μmol/L），每组设 6 个复孔。吸弃各孔上清液，对照                   缺血性心肌呈深蓝色，梗死区（INF）则呈苍白色；TTC染
        组和模型组加入完全培养基0.5 mL，各给药组加入含相                        色后呈淡红色的活组织被定义为危险区（AAR）]，并计
        应药物的完全培养基0.5 mL，继续培养30 min。除对照                     算同一切面内心肌梗死面积占横截面积百分比（即 INF
        组外，其余各组细胞均按“2.1.1”项下方法复制心肌缺血                       与切片横截总面积的比值）。
        再灌注损伤模型。再灌注 3 h 后，每孔加入 MTS 溶液                      2.2.3  血清指标检测        取各组余下 9 只小鼠，均摘除眼
       （以DMEM高糖培养基为溶剂）100 μL，培养3 h后，使用                     球取血，室温放置1 h后，于4 ℃下以2 000 r/min离心10
        酶标仪于490 nm波长处检测各孔的吸光度值，并计算细                        min，分离血清。严格按照相应试剂盒说明书操作，采用
        胞存活率（细胞存活率＝试验组细胞平均吸光度值/对照                          WST-1法以酶标仪检测小鼠血清中SOD的活性及MDA
        组细胞平均吸光度值×100％）。上述试验重复3次。                          的含量。
        2.1.3  凋亡蛋白表达量检测           采用 Western blotting 法   2.2.4  心脏组织中凋亡蛋白表达量及通路相关蛋白磷
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        检测。取对数生长期的细胞适量，以5×10 个/mL的密度                       酸化水平检测 采用Western blotting法检测。取“2.2.3”
        按2 mL/孔接种至6孔板中，培养24 h。将细胞随机分为                      项下各组小鼠心脏组织适量，匀浆，以12 000 r/min离心
        对照组、模型组和EGCG低、高剂量组（100、200 μmol/L，                 10 min，超声（功率：250 W，频率：25 kHz）粉碎，以12 000
        剂量设置参考“2.1.2”项检测结果），每组设3个复孔。吸                      r/min 离心 30 min，取上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓
        取各孔上清液，对照组和模型组加入完全培养基2 mL，                         度。蛋白经变性后，进行 SDS-PAGE 电泳，电泳后转移
        各给药组加入含相应药物的完全培养基2 mL，继续培养                         至PVDF膜上，以5％脱脂奶粉室温封闭2 h，用TBST溶
        48 h。除对照组外，其余各组细胞均按“2.1.1”项下方法                     液洗膜 10 min×3 次，加入相应一抗[GAPD 的稀释度为
        复制心肌缺血再灌注损伤模型。再灌注 3 h 后，裂解细                        1 ∶ 5 000，其余蛋白的稀释度均为 1 ∶ 1 000]，4 ℃孵育
        胞，采用 BCA 法测定蛋白浓度。蛋白经变性后，进行                         过夜；用 TBST 溶液洗膜 10 min×3 次，加入相应二抗
        SDS-PAGE 电泳，然后转移至 PVDF 膜上，以 5％脱脂奶                  （1 ∶ 5 000），室温孵育 2 h；TBST 溶液洗膜 10 min×3 次，
        粉室温封闭 2 h，用 TBST 溶液洗膜 10 min×3 次；加入相               以 ECL 试剂显色后，置于凝胶成像系统上成像，并使用
        应一抗[GAPDH 的稀释度为 1 ∶ 5 000，Bcl-2、Bax 的稀释            Image Lab 5.2.1 软件分析。凋亡蛋白（Bcl-2、Bax）的相
        度均为 1 ∶ 1 000]，4 ℃孵育过夜；用 TBST 溶液洗膜 10              对表达量以其与内参（GAPDH）条带的灰度值比值来表
        min×3 次，加入相应二抗（稀释度为 1 ∶ 5 000），室温孵育                示，PI3K/Akt 通路相关蛋白的磷酸化水平以 p-PI3K 与
        2 h；TBST溶液洗膜10 min×3次，以ECL试剂显色后，置                  PI3K、p-Akt 与 Akt 条带的灰度值比值（即 p-PI3K/PI3K、
        于凝胶成像系统上成像，并使用 Image Lab 5.2.1软件分                  p-Akt/Akt值）来表示。上述实验重复3次。
        析。Bcl-2、Bax 的相对表达量以其与内参（GAPDH）条                    2.3 统计学方法
        带的灰度值比值来表示。上述试验重复3次。                                   采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
        2.2  动物实验                                          料 以 x ± s 表 示 ，多 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析
        2.2.1  分组、造模与给药        所有小鼠均适应性喂养 1 周              （One-way ANOVA），两组间比较采用Bonferroni校正的


        中国药房    2019年第30卷第16期                                            China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 16  ·2189  ·
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