Page 75 - 《中国药房》2026年9期
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2.2 造模、分组与给药                                       说明书方法提取总 RNA，再反转录为 cDNA，以 cDNA
              将所有大鼠适应性喂养 1 周后，取 45 只复制 RF 模                  为模板进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件为 95 ℃预变性
          型：大鼠每天灌胃腺嘌呤混悬液（250 mg/kg）1 次，连续                    120 s；95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 60 s，40 个循环。以
                                       [16]
          15 d；然后改为隔日 1 次，连续 15 d 。末次给药 2 h 后，               β-actin为内参，采用2    －ΔΔCt 法测定TGF-β1、Smad3、ERK1、
          随机选取 5 只造模大鼠和 3 只不造模大鼠，经麻醉后腹                       ERK2 mRNA的表达水平。
          主动脉取血，测定血清中 BUN、Cr 水平，随后剖取肾脏                       2.8 大鼠肾组织中TGF-β1、Smad3、p-Smad3、ERK1/2、
          进行HE染色。若造模大鼠血清中BUN、Cr水平相比不                         p-ERK1/2蛋白表达水平检测
          造模大鼠明显升高，且肾脏病理学形态提示肾小管萎                                取“2.3”项下各组 3 只大鼠肾组织适量，加入 RIPA
          缩、空泡变性、炎症细胞浸润等典型 RF 特征，则表明造                        裂解液提取总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度后，将蛋白
          模成功。将造模成功的 40 只大鼠采用随机数字表法分                         进行变性处理；取变性后的蛋白30 μg，进行十二烷基硫
                                                [10]
          为模型组、阳性对照组（秋水仙碱，0.45 mg/kg ）及镰形                    酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭后，加入 TGF-
          棘豆炮制品低、中、高剂量组（0.5、1、2 g/kg，剂量根据人                   β1、Smad3、p-Smad3、ERK1/2、p-ERK1/2 一抗（稀释度均
          和动物体表面积比率表计算而得 ，其中中剂量为临床                           为1∶1 500）于4 ℃条件下孵育过夜；次日加入相应二抗
                                      [17]
          等效剂量，低、高剂量分别为等效剂量的0.5、2倍），每组                      （稀释度为 1∶10 000）室温孵育 2 h，经发光液处理后，采
          8只。另取8只不造模的大鼠作为空白组。阳性对照组                           用凝胶成像系统成像，然后采用 Image J 软件分析蛋白
          和镰形棘豆炮制品各剂量组大鼠灌胃相应药液，空白                            灰度值。以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值
          组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，灌胃体积为 10                          反映目的蛋白的表达水平，以 p-Smad3 与 Smad3、p-
          mL/kg，每天1次，连续28 d。                                 ERK1/2与ERK1/2的表达水平比值反映Smad3、ERK1/2
          2.3 样本收集与处理                                        蛋白的磷酸化水平。
              末次给药 24 h 后，各组大鼠称重后以 3% 戊巴比妥                   2.9 统计学方法
          钠麻醉；经腹主动脉取血，血样以 3 000 r/min 离心 10                      采用SPSS 26.0软件进行统计分析。所有计量数据
          min，取上层血清置于－80 ℃条件下保存。取血完成                         均服从正态分布且方差齐性，以 x±s 表示，多组间比较
          后，处死大鼠，剖取肾脏，以生理盐水洗净，拍照；将肾脏                         采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 SNK-q 检
          分成两份，其中一份用4%多聚甲醛固定，另一份用液氮                          验。检验水准α＝0.05。
          速冻后置于－80 ℃条件下保存。                                   3 结果
          2.4 大鼠肾组织病理学形态观察                                   3.1 镰形棘豆炮制品对大鼠肾脏外观的影响
              取各组大鼠于 4% 多聚甲醛中固定的肾组织适量，                           空白组大鼠肾脏形态结构完整，色泽鲜红，表面光
          经过脱水、透明、包埋、切片、脱蜡后，取一部分切片进行                         滑；模型组大鼠肾脏体积较空白组明显增大，颜色苍白，
          HE 染色，一部分切片进行 Masson 染色（剩余部分用于                     表面粗糙不平，呈颗粒样改变；阳性对照组和镰形棘豆
          免疫组化染色），采用光学显微镜观察大鼠肾组织病理                           炮制品各剂量组大鼠肾脏病理改变较模型组明显减轻，
          学形态变化。                                             但肾脏表面仍呈缺血状态。结果见图1。
          2.5 大鼠血清中肾功能指标和炎症因子水平检测
              取各组大鼠血清适量，按照试剂盒说明书方法操
          作，使用酶标仪分别检测大鼠血清中肾功能指标（BUN、
          Cr）和炎症因子（IL-6、TNF-α）水平。
          2.6 大鼠肾组织中α-SMA、Col-Ⅰ、FN蛋白表达水平检测
              采用免疫组化法检测。取“2.4”项下切片（每组取3
                                                                  A.空白组           B.模型组          C.阳性对照组
          只大鼠），经脱蜡、水化、抗原修复、山羊血清封闭等处理
          后，滴加α-SMA、Col-Ⅰ、FN抗体（稀释度为1∶250）孵育
          过夜，次日加入二抗（稀释度为 1∶500）；经 DAB 显色和
          苏木精染色后，进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树
          脂封片，采用光学显微镜观察目的蛋白的阳性表达（呈
          棕黄色或棕褐色）情况；每张切片随机选取5个不重叠的                            D.镰形棘豆炮制品       D.镰形棘豆炮制品       D.镰形棘豆炮制品
                                                                  低剂量组            中剂量组            高剂量组
          高倍视野，采用Image-Pro Plus 6.0软件对阳性表达区域
                                                                       图1 各组大鼠肾脏外观观察图
          的平均光密度（mean optical density，MOD）进行定量分析，
          以MOD值表示α-SMA、Col-Ⅰ、FN蛋白的表达水平。                      3.2 镰形棘豆炮制品对大鼠肾功能指标和炎症因子水
          2.7  大 鼠 肾 组 织 中 TGF- β1、Smad3、ERK1、ERK2           平的影响
          mRNA表达水平检测                                             与空白组比较，模型组大鼠血清中 BUN、Cr、IL-6、
              取“2.3”项下各组3只大鼠肾组织适量，根据试剂盒                      TNF-α 水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性


          中国药房  2026年第37卷第9期                                                China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 9    · 1169 ·
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