Page 92 - 《中国药房》2026年7期
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民医院伦理委员会批准[批件号：伦审（2025）-2-800号]，                    2 000×g 离心 10 min，收集上层匀浆液。按照试剂盒说
          实验操作均遵照实验动物福利伦理相关规范进行。                              明书操作，测定肾组织中GSH、SOD和MDA水平。
          2 方法                                                2.5 肾组织中Notch1通路相关蛋白检测
          2.1 造模、分组与给药                                        2.5.1 免疫组化染色法
              大鼠适应性饲养5 d后，随机选取40只，按文献[10]                         取“2.3”项下肾组织切片，依次进行烤片、脱蜡、复水
          方法建立DN大鼠模型。首先，建立糖尿病大鼠模型——                           和微波加热抗原修复后，以 3%H2O2 处理 10 min，用
          先以高脂饮食饲养5周，随后连续3 d每日腹腔注射1次                          5%BSA 封闭 30 min。将切片置于 37 ℃恒温湿盒中，分
          链脲佐菌素（30 mg/kg）；检测大鼠空腹血糖水平，当空腹                      别与一抗[Notch1（稀释比例为1∶200）、NICD（稀释比例
          血糖水平＞16.7 mmol/L，视为糖尿病模型构建成功。接                      为 1∶100）、Hes1（稀释比例为 1∶100）、Dll1（稀释比例为
          着，继续予以高脂饮食饲养12周。在糖尿病模型建立成                           1∶200）]一起孵育 1.5 h。洗片后，依次滴加聚合物增强
          功并继续以高脂饮食饲养第4周末（即整个高脂饮食的                            剂（37 ℃孵育 25 min）和 HRP 标记山羊抗兔聚合物（稀
          第9周末），若检测到大鼠空腹尿微量白蛋白呈阳性（视                           释比例为1∶200，37 ℃孵育30 min）。洗涤后，以DAB显
          为DN早期阶段），即认为DN大鼠模型构建成功。最终                           影，苏木素复染，于光学显微镜下观察目标蛋白表达情
          共有36只大鼠造模成功。                                        况并采集图像，每张切片随机选取5个不重叠视野进行
              将造模成功的 36 只大鼠按照随机数字表法分为模                        分析。遵循文献[5，10―11]方法，采用双参数免疫组化
          型组和低、高剂量chsⅣ组，每组12只。低、高剂量chsⅣ
                                                              评分法（H-score 改良版）进行半定量分析。该法依据染
          组大鼠在糖尿病建模后的第 5 周起至第 12 周分别每日
                                                              色强度（0～3分）和阳性细胞百分比（0～4分）2项指标，
          灌胃 90、180 mg/kg 的 chsⅣ（剂量参考文献[8]设定），全
                                                              将各自得分相乘获得最终评分（范围为 0～12 分），分值
          程维持高脂饮食；模型组大鼠灌胃等体积生理盐水；另
                                                              越高表明目标蛋白表达水平越强。
          取10只正常大鼠作为对照组，全程常规饮食喂养，并同
                                                              2.5.2 Western blot法
          步灌胃等体积生理盐水。
                                                                  取“2.3”项下大鼠新鲜肾组织，采用 RIPA 裂解液提
          2.2 血糖水平、胰岛素抵抗和肾功能指标检测
                                                              取肾组织中总蛋白，经 BCA 法测定总蛋白浓度并进行
              给药结束后，大鼠禁食、禁水 8 h，测定其空腹血糖
                                                              变性处理后，取蛋白经 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
          水平；次日清晨收集其尿液和尾静脉血。将血液于4 ℃
                                                              胺凝胶电泳分离，随后在恒流（200 mA）条件下将蛋白转
          下以2 500×g离心5 min，分离血清。依据相应试剂盒说
                                                              印（转膜时间90 min）至PVDF膜，以5%脱脂牛奶-TBST
          明书操作，分别检测血清中INS、BUN和SCr水平以及尿
                                                              溶液室温封闭 1 h。将膜分别与一抗 Notch1（稀释比例
          液中 UPRO 水平。计算胰岛素抵抗指数（homeostasis
                                                              为 1∶2 000）、NICD（稀释比例为 1∶1 000）、Hes1（稀释比
          model  assessment  for  insulin  resistance，HOMA-IR）：
                                                              例为1∶500）、Dll1（稀释比例为1∶800）、GAPDH（稀释比
          HOMA-IR＝空腹血糖水平（mmol/L）×空腹 INS 水平
                                                              例为1∶8 000）在37 ℃条件下孵育2 h；经TBST洗涤3次
         （μU/mL）/22.5。
                                                              后，与HRP标记山羊抗兔IgG二抗（稀释比例为1∶2 000）
          2.3 肾组织病理形态学分析
                                                              室温孵育1 h；再次洗涤后，用ECL Western blot化学发光
              取血后，大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）深
                                                              底物使蛋白条带显像，用 Western blot 成像系统采集蛋
          度麻醉，迅速取出其双侧肾组织。将部分新鲜肾组织用
                                                              白条带图像，利用 Image J 18.0 软件分析目标蛋白条带
          于组织生化与 Western blot 分析；另一部分肾组织经 4%
                                                              的光密度值，计算目标蛋白相对表达量。目标蛋白相对
          多聚甲醛固定、石蜡包埋后制备6 μm厚切片，常规进行
          苏木精-伊红（HE）、过碘酸希夫（periodic acid Schiff，              表达量＝目标蛋白条带的光密度值/内参（GAPDH）蛋白
          PAS）和Masson染色。肾组织病理学评估于光学显微镜                        条带的光密度值。
         （×40 物镜）下进行，由研究者参照文献[11―12]方法进                       2.6 统计学方法
          行肾脏组织学评分、系膜扩张指数测定以及肾小球硬化                                采用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析。符合
          评分。每只大鼠至少分析10张非连续切片，每张切片随                           正态分布的数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方
          机选取 20 个肾皮质视野或 20～30 个肾小球，取平均值                      差分析，组间两两比较采用 Bonferroni 检验。检验水准
          作为最终评分。                                             α＝0.05。
          2.4 肾组织中GSH、SOD和MDA水平测定                             3 结果
              称取“2.3”项下大鼠新鲜肾组织（每只称取10 mg），                    3.1 大鼠血糖水平、胰岛素抵抗和肾功能指标测定结果
          置于1.0 mL冷生理盐水中研磨匀浆30 min，将匀浆液以                          与对照组比较，模型组大鼠空腹血糖水平，血清中


          · 910 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 7                               中国药房  2026年第37卷第7期
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