Page 57 - 《中国药房》2026年7期
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1.3 实验动物 分离其海马组织，－80 ℃冻存，用于后续实时荧光定量
本研究所用动物为 60 只 7 周龄 SPF 级 SD 雄性大 PCR、Western blot 实验及 ATP 含量测定；每组剩余 3 只
鼠，体重（220±20） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有 大鼠的脑组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋制片（厚度
限公司[动物生产许可证号为 SCXK（湘）2019-0004]，实 约5 μm），后续行苏木精-伊红（HE）、尼氏及免疫荧光染
验动物使用合格证号为 SYXK（桂）2019-0001。所有大 色分析。
鼠均饲养于广西中医药大学实验动物中心 SPF 级屏障 2.5 大鼠血清中TNF-α和IL-4含量测定
环境中，在恒温（24±1） ℃、12 h光/12 h暗循环条件下进 采用 ELISA 法检测。取“2.4”项下每组 6 只大鼠的
行标准化饲养。本实验中所有动物的操作均符合动物 血清，按 ELISA 试剂盒说明书操作，使用酶标仪在 450
福利伦理相关规定，并经广西中医药大学动物实验伦理 nm 波长下测定各孔吸光度。依据标准曲线回归方程，
委员会审核通过（批准号：DW20240507-118-02）。 计算大鼠血清中TNF-α和IL-4的含量。
2 方法 2.6 大鼠海马组织病理形态学观察
2.1 药液的制备 采用 HE 和尼氏染色法观察。取“2.4”项下脑组织
按 YFXF 处方组成称取相应药材（黄芪、人参、麦 石蜡切片，脱蜡复水后，常规行 HE 染色和尼氏染色，于
冬、三七、苏子及石菖蒲各15 g，桔梗、苦杏仁各10 g，酒 光学显微镜下检视大脑海马组织病理形态学改变情况
大黄6 g），加2 000 mL水煎煮提取3次（2 h/次），合并滤 并采集图像。
液，经 45 ℃减压浓缩制成生药质量浓度为 24.36 g/mL 2.7 大鼠海马组织中 GRB2/ERK/CRLS1 通路相关蛋
的药液，于 4 ℃条件下保存。另将盐酸多奈哌齐片研 白表达检测
细，以蒸馏水溶解，配制成质量浓度为0.045 mg/mL的阳 采用 Western blot 法检测。取“2.4”项下每组 3 只大
性对照溶液。 鼠的海马组织，经低温匀浆、RIPA裂解液提取总蛋白并
2.2 造模、分组与给药 离心后，取上清用 BCA 法测定蛋白浓度并变性处理。
首先将 SD 大鼠随机分配至假手术组（SHAM，n＝ 取 10 μg 变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
12）和造模组（n＝48）。在异氟烷吸入麻醉下，造模组大 胶电泳分离，再转印至PVDF膜，随后以5%脱脂牛奶室
鼠采用双侧颈总动脉永久性结扎法构建 VAD 模型， 温封闭 2 h。洗膜后，将膜与一抗（GAPDH、GRB2、ERK
[11]
SHAM组大鼠仅游离血管 。术后3 d，通过水迷宫实验 的稀释比例均为 1∶2 000，p-ERK 的稀释比例为 1∶500，
评估大鼠认知功能，以SHAM组大鼠逃避潜伏期为参考 CRLS1 的稀释比例为 1∶1 500）及二抗（稀释比例为 1∶
值，计算两组大鼠（每组选6只）逃避潜伏期的差值与参考 1 0000）依次孵育。显影后获取图像，借助 Image J 软件
值之比，若该比值＞20%，则评定VAD模型构建成功 。 测定条带灰度值，以p-ERK与ERK的条带灰度值比值表
[11]
选取造模成功的 48 只大鼠随机分为模型组（MOD 示ERK蛋白的磷酸化水平，以目的蛋白与内参（GAPDH）
组），YFXF低、高剂量组（YFXF-L、YFXF-H组），盐酸多 蛋白的条带灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
奈哌齐（DH）组（阳性对照组），每组12只。YFXF-L组、 2.8 大鼠海马组织中CRLS1蛋白表达检测
YFXF-H 组大鼠分别灌胃 12.18、24.36 g/kg 的 YFXF 药 采用免疫荧光法检测。取“2.4”项下每组 3 只大鼠
液（以生药总量计，分别为临床等效剂量的 1、2 倍），DH 的脑组织石蜡切片，经抗原修复与血清封闭后，与
组大鼠灌胃 0.2 g/kg 的阳性对照药溶液（为临床等效剂 CRLS1 一抗（稀释比例为 1∶500）在 4 ℃下孵育过夜，然
量），SHAM组和MOD组大鼠灌胃等体积生理盐水。每 后与相应荧光二抗（稀释比例为 1∶500）在室温下孵育 2
天给药/生理盐水1次，持续30 d。 h。采用DAPI标记细胞核以进行定位，封片后利用荧光
2.3 大鼠空间认知能力评估 显微镜观察海马组织中 CRLS1 的红色荧光阳性表达情
药物干预结束后，通过Morris水迷宫实验评估大鼠 况，采用Image J软件计算CRLS1的平均荧光强度（荧光
的空间认知能力。实验分两个阶段进行：实验前 5 d 为 强度越强表明蛋白表达水平越高）。
定位航行实验——记录大鼠从下水到爬上隐蔽平台（第 2.9 大鼠海马组织中 GRB2、CRLS1、TAZ、PLSCR3、
2象限，水下3 cm）所需的时间，即逃避潜伏期；未找到平 ND1 mRNA表达检测
台的大鼠由实验者引导上台并停留10 s，其逃避潜伏期 取“2.4”项下每组3只大鼠的海马组织，提取组织中
记为60 s。实验第6天开展空间探索测试——撤去平台 总 RNA，经浓度与纯度检测合格后，将 RNA 反转录为
后，统计60 s内大鼠穿越平台次数。 cDNA，并以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。
2.4 标本制备 扩增体系（总体积 20 μL）为：SYBR Green Master Mix 5
Morris水迷宫实验结束后，腹腔注射20%乌拉坦麻 μL，cDNA 模板 1 μL，上、下游引物各 0.4 μL，无核酸酶
醉大鼠，经腹主动脉采血，离心（3 000 r/min，15 min）分 水 13.2 μL。扩增条件为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性
离血清，置于－80 ℃冰箱保存。每组随机取 9 只大鼠， 10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。采集荧光信号，
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