Page 71 - 《中国药房》2026年3期
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染色试剂盒、二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）探针（批                热10 min，使尾动脉充盈；待大鼠安静稳定后，再开始测
          号分别为 C0105S、Y257746）均购自上海碧云天生物技                    量。测量工作由专人在测量日的 15：00－17：00 进行。
          术有限公司；兔源CYP4A单克隆抗体、兔源内皮型一氧                         每只大鼠重复测量3次，取平均值作为当日收缩压。
          化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）多克     2.4 血清中血管活性物质、炎症因子和氧化应激指标水
          隆抗体、兔源 p22    phox 多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记                 平测定
          的山羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗（批号分别为 ab140635、                        末次给药后，各组大鼠禁食不禁水 12 h，腹腔注射
          ab317582、ab191512、ab6721）均购自英国 Abcam 公司；           20% 乌拉坦（5 mL/kg）麻醉，然后腹主动脉取血。血样
          兔源 GPR75、NF-κB p65、磷酸化 NF-κB p65（p-NF-κB           于 4 ℃下以 1 000×g 离心，分离血清，按照对应的试剂
          p65）、NADPH 氧化酶 4（NADPH oxidase 4，NOX4）和甘           盒说明书操作，测定血清中血管活性物质（20-HETE、
          油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶（GAPDH）抗 体（批 号 分 别 为              Ang-Ⅱ、NO、ET-1）、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-
          DF2761、AF5006、AF3387、DF6924、AF7021）均购自美            1）和氧化应激指标（SOD、MDA、GSH-Px、CAT）的水平。
          国Affinity公司。                                       2.5 胸主动脉病理形态学变化观察
          1.3 实验动物                                               采用 HE 染色法观察。取血后，小心分离大鼠胸主
              40只雄性SPF级8周龄SHR及10只同背景、同周龄                     动脉，将部分胸主动脉放入－80 ℃冰箱中保存，用于后
          的雄性 Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（体重 180～200 g）均             续检测。另取长度约 0.5 cm 的胸主动脉段，用 4% 多聚
          购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许                           甲醛固定，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明后制备石蜡切
          可证号为SCXK（京）2021-0006。动物购入后，饲养于河                    片（厚度为 5 μm），将切片脱蜡水化后进行 HE 染色，最
          南省中医药研究院实验动物中心，饲养环境温度为22～                          后在光学显微镜下观察胸主动脉的病理形态学变化。
          25 ℃、相对湿度为50%～60%。本实验获得河南省中医                       2.6 胸主动脉中活性氧水平测定
          药 研 究 院 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 批 准（批 准 编 号 ：                采用DHE探针法检测。将“2.5”项下分离的新鲜胸
          HNTCMDW-20240301）。                                 主动脉包埋于 OCT 中，制备厚度为 5 μm 的切片。切片
          2 方法                                               经磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗 2 min 后，用 5 μmol/L 的
          2.1 ABS提取物的制备                                      DHE 在室温下避光孵育 30 min；经 PBS 漂洗后封片，采
              将牛膝饮片粉碎，过20目筛。称取200 g药材粉末，                     用荧光显微镜观察并拍照，阳性表达呈红色荧光。采用
          加入 8 倍量的 95% 乙醇加热回流提取 3 次，每次 1 h；合                 Image J 软件分析活性氧（reactive oxygen species，ROS）
          并 3 次提取液，70 ℃水浴旋蒸浓缩至无醇味，用纯水将                       的荧光强度，荧光强度越强表示ROS水平越高。
          剩余提取液定容至 2 L，超声 10 min，抽滤；量取 300 mL                2.7 胸主动脉中eNOS水平检测
          抽滤液，过 D101 型大孔吸附树脂柱，然后用 1.2 L 纯水                       采用免疫荧光法检测。将“2.5”项下胸主动脉切片
          洗脱其中的水溶性成分，再用70%乙醇1 L洗脱，收集乙                        脱蜡至水，用 EDTA 抗原修复液进行高温抗原修复，随
          醇洗脱液并干燥，得到ABS提取物。以齐墩果酸对照品                          后用PBS清洗3次，每次5 min；甩干切片后，以10%山羊
                                        [7]
          为参照，采用紫外-可见分光光度法 进行分析，得到提                          血清在室温下封闭 1 h；滴加 eNOS 一抗（稀释比例为 1∶
          取物中ABS的含量为54.76%。                                  200），于4 ℃下孵育过夜；PBS漂洗3次，滴加二抗（稀释
          2.2 动物分组与给药                                        比例为1∶200），于37 ℃下避光孵育1 h；滴加DAPI复染
              所有大鼠适应性喂养 1 周后，将 10 只 WKY 大鼠设                  细胞核，并用抗荧光淬灭封片剂封片。最后采用荧光显
          为正常对照组（CON 组）；40 只 SHR 先根据收缩压进行                    微镜观察并采集图像，阳性表达呈绿色荧光。用Image J
          分层，再采用随机数字表法分为模型组（MOD组）、卡托                         软件计算 eNOS 荧光强度，荧光强度越强表明 eNOS 水
          普利阳性对照组（CAP 组，10 mg/kg，剂量参考文献[10]                  平越高。
          设置）和 ABS 提取物低、高剂量组（ABS-L、ABS-H 组，                  2.8 胸主动脉中CYP4A/20-HETE/GPR75轴相关蛋白
          60、120 mg/kg，剂量参考文献[7]设置），每组 10 只。                 表达检测
          CON组和MOD组大鼠灌胃纯水，其余各组大鼠灌胃相                              采用Western blot法检测。称取“2.5”项下冻存的胸
          应药物，给药体积为10 mL/kg，每天1次，连续给药28 d。                   主动脉（每只约 100 mg），用 RIPA 裂解液提取组织中的
          2.3 收缩压测量                                          总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度后将蛋白煮沸变性。
              分别于给药前及给药后 7、14、28 d，采用动物无创                    取 50 μg 蛋白上样进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
          血压测试仪测量大鼠的尾动脉收缩压。测量前需确保                            胺凝胶电泳（电压120 V，电泳时间90 min），电泳结束后
          环境安静、温暖。测量时，先打开加热垫对大鼠尾部加                           电转（电流 200 mA，转膜时间 60 min）至 PVDF 膜，在室


          中国药房  2026年第37卷第3期                                                 China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 3    · 333 ·
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