Page 46 - 《中国药房》2026年2期
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2.2 大鼠CRF模型构建                                       μmol/L DCFH-DA 探针工作液于黑色 96 孔板中充分混
              大鼠适应性喂养 1 周后，选取 55 只进行模型构建。                     合，于37 ℃避光孵育30 min后，立即加入4 ℃预冷磷酸
                      [5]
          参考相关文献 和预实验结果确定，用含0.5%腺嘌呤的                          盐缓冲液终止反应，使用酶标仪在激发波长530 nm条件
          饲料喂养21 d建立CRF大鼠模型。喂养结束后，若大鼠                         下立即检测荧光强度。荧光强度越高，代表ROS表达水
          血肌酐（Serum creatinine，Scr）和尿素氮（blood urea ni‐        平越高。
          trogen，BUN）含量均显著升高，则初步判断 CRF 模型构                    2.8 大鼠血清中氧化应激标志物和炎症因子水平检测
          建成功。随后，随机选取2只造模大鼠安乐死后，镜下观                               取“2.4.1”项下血清样本，按照试剂盒的操作方法分
          察其肾脏出现肾间质纤维化和大量炎性细胞浸润等严                             别检测各组大鼠血清中 SOD 和 MDA 水平，按照 ELISA
          重病理改变，由此确认CRF大鼠模型造模成功。                              试剂盒说明书操作检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平。
          2.3 分组及处理                                           2.9 大鼠肾组织中肾纤维化标志蛋白检测
              将 50 只 CRF 大鼠随机分为模型组、益肾排毒方低                         采用免疫组化法进行检测。取“2.6”项下肾组织石
          剂量（益肾排毒方-L）组、益肾排毒方高剂量（益肾排毒                          蜡切片，经脱蜡、水化、抗原修复、内源性过氧化物酶阻
          方-H）组、益肾排毒方-H+pcDNA-NC组、益肾排毒方-H+                    断后，用 5% 牛血清白蛋白室温孵育 30 min，再于 37 ℃
          pcDNA-TXNIP组，每组10只。另取10只正常大鼠作为                      下用 Collagen Ⅲ、α-SMA、TGF-β1抗体（稀释比例均为
          对照组，采用常规饲料喂养21 d。CRF大鼠模型构建成                         1∶500）孵育 2 h，滴加二氨基联苯胺染色 5 min，水洗终
          功次日，开始给药处理。益肾排毒方-L 组、益肾排毒                           止，苏木精复染 1 min 后，脱水、透明、封片，使用显微镜
          方-H 组大鼠分别灌胃 1.89、7.56 g/kg 益肾排毒方药液                  观察阳性信号。阳性信号判定依据如下：在显微镜图像
         （以生药量计，依据临床等效剂量换算），益肾排毒方-H+                          中，于目标组织结构的正确解剖部位（如肾间质、肌成纤
          pcDNA-NC组、益肾排毒方-H+pcDNA-TXNIP组大鼠在                   维细胞细胞质、肾小管上皮细胞细胞质）出现棕黄色或
          灌胃 7.56 g/kg 益肾排毒方药液的基础上分别尾静脉注                      褐色特异性染色颗粒。
          射2.5 µL pcDNA-NC或pcDNA-TXNIP慢病毒质粒（1×                2.10 大鼠肾组织中TXNIP、NLRP3蛋白表达检测
                    [6]
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          10  TU/mL） ，对照组和模型组大鼠分别灌胃等体积的                           采用 Western blot 进行检测。取“2.4.2”项下冻存的
          生理盐水，每日1次，连续8周。                                     各组大鼠右肾组织，使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑
          2.4 样本采集                                            制剂的RIPA缓冲液裂解，提取蛋白质，使用BCA蛋白测
          2.4.1 血清标本                                          定试剂盒测定蛋白浓度，加热变性。取变性后样品，电
              末次给药 24 h 后，麻醉大鼠，抽取股动脉血于普通                      泳分离后，转膜、封闭，加入 TXNIP、NLRP3、GAPDH 抗
          生化管中，静置后离心分离血清，分别用于 ELISA 和生                        体（稀释比例均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；次日，加
          化检测。                                                入二抗（稀释比例为 1∶2 000），室温孵育 2 h。使用
          2.4.2 组织标本                                          Amersham Biosciences ECL检测系统对蛋白条带进行可
              大鼠取血后，于无菌操作台上取出双侧肾脏，剥离                          视 化 ，并 通 过 Image  J 软 件 分 析 目 的 蛋 白 与 内 参
          被膜后将左侧肾脏置于 4% 多聚甲醛中固定，用于苏木                         （GAPDH）的灰度值比值以表示目的蛋白的表达水平。
          精-伊红（HE）、Masson 染色和免疫组化检测；右侧肾脏                      2.11 统计分析
          放入 20 mL 冻存管中，存入液氮罐，用于 Western blot                     采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。计量资
          检测。                                                 料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
          2.5 大鼠肾功能指标检测                                       步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
              取“2.4.1”项下血清样本，通过全自动生化分析仪检                      3 结果
          测各组大鼠血清中Scr和BUN水平。                                  3.1 益肾排毒方对CRF大鼠肾功能的影响
          2.6 大鼠肾组织病理学观察                                          与对照组比较，模型组大鼠血清中Scr、BUN水平均
              取“2.4.2”项下固定过夜的肾组织，经乙醇脱水、二                      显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，益肾排毒方-L组和
          甲苯透明、石蜡包埋、浸蜡后，制成石蜡切片。取部分石                           益肾排毒方-H组大鼠血清中Scr、BUN水平均显著降低
          蜡切片脱蜡后分别进行常规HE和Masson染色，在显微                        （P＜0.05），且益肾排毒方-H 组降低更显著（P＜0.05）；
          镜下观察各组大鼠肾组织的病理形态变化及纤维化                              与益肾排毒方-H 组比较，益肾排毒方-H+pcDNA-NC 组
          程度。                                                 大鼠血清中上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与
          2.7 大鼠血清中ROS表达水平检测                                  益肾排毒方-H+pcDNA-NC 组比较，益肾排毒方-H+
              取“2.4.1”项下血清样本，按1∶20比例用无菌磷酸盐                    pcDNA-TXNIP组大鼠血清中Scr、BUN水平均显著升高
          缓冲液进行稀释。取100 μL稀释后血清与等体积的10                        （P＜0.05）。结果见表1。


          · 176 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 2                               中国药房  2026年第37卷第2期
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