Page 27 - 《中国药房》2026年2期
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2.2 分组、造模与给药                                       2.8 肺组织中NF-κB、NLRP3、caspase-1蛋白表达检测
              将大鼠随机分为正常组，模型组，蠲哮汤低、中、高                        2.8.1 免疫组化实验
          剂量组，阳性对照组，每组10只。除正常组外，其余各组                             取“2.7”项下各组大鼠的肺组织切片，进行抗原修
                            [9]
          大鼠均参考相关文献 方法造模：将大鼠置于气雾装置                           复后再进行内源性过氧化物酶清除，以 PBS（含 10% 驴
          内，在实验的第 1 天和第 8 天通过腹腔注射的方式给予                       血清）封闭；加入 NF-κB、NLRP3、caspase-1 一抗（稀释
          鸡卵清白蛋白10 mg和氢氧化铝溶液100 mg；从实验的                      比例均为 1∶1 000），于 4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗
          第 14 天起，用 2% 鸡卵清白蛋白雾化吸入激发哮喘，每                     （稀释比例为 1∶5 000），于室温下孵育；经 3，3′-二氨基
          天 1 次，每次 0.5 h，连续 7 d。在雾化吸入同时，蠲哮汤                  联苯胺显影、苏木精复染后漂洗，再经干燥、密封后，使
          低、中、高剂量组大鼠分别按0.36、0.72、1.44 g/kg的剂量                用显微镜观察并采集图像，运用 Image J 图像分析软件
          灌胃蠲哮汤药液（以生药量计。60 kg 成人的生药使用                        对蛋白表达阳性区域（呈棕色）的平均光密度进行定量
          量为 1.25 g/kg，根据剂量换算系数估算，大鼠等效剂量                     分析。
          约为成人的 6 倍；本文所设低、中、高 3 个剂量分别相当
                                                             2.8.2 Western blot实验
          于临床等效剂量的 0.048、0.096、0.192 倍 ），阳性对照
                                             [10]
                                                                 取各组大鼠冻存的肺组织适量，研磨后加入裂解
          组大鼠按 0.2 mg/kg 的剂量灌胃地塞米松（以生理盐水                     液，匀浆，离心后分离上层蛋白；采用 BCA 法测定蛋白
                 [11]
          为溶剂） ，正常组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐                            浓度后，以沸水浴加热使蛋白变性。取变性蛋白适量，
          水，每天1次，连续7 d。
                                                             经凝胶电泳分离后转膜、封闭1 h；洗膜后，加入NF-κB、
          2.3 肺功能指标检测                                        NLRP3、caspase-1、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000）；
              末次给药后，待各组大鼠适应 30 min，采用肺功能
                                                             洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），于室温下
          检测仪记录其在呼吸稳定状态下的关键肺功能指标，包
                                                             孵育；洗膜后，进行显影、成像。采用 Image J 图像分析
          括用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、第0.3秒用力
                                                             软件对各蛋白的条带灰度值进行分析，以各目的蛋白与
          呼气容积（forced expiratory volume in 0.3 second，FEV0.3 ）
                                                             内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示各目的蛋白的表
          和呼气流量峰值（peak expiratory flow，PEF）。
          2.4 取材                                             达水平。
                                                             2.9 肺组织中 NF-κB、NLRP3、caspase-1 mRNA 表达
              检测肺功能指标后，以1%戊巴比妥钠（4 mL/kg）腹
          腔注射麻醉各组大鼠，然后采集其腹主动脉血4 mL，离                         检测
                                                                 取各组大鼠冻存的肺组织适量，加入TRIzol试剂提
          心后分离上层血清，备用。随后，将各组大鼠处死，切开
          其颈气管，向气管内注射生理盐水1 mL，再慢慢抽出，重                        取总RNA，经测定浓度、纯度后，按反转录试剂盒说明书
          复 3 次，取抽出液 2.4 mL，即支气管肺泡灌洗液（bron‐                  方法将总 RNA 反转录成 cDNA，然后以此为模板，进行
          choalveolar lavage fluid，BALF），离心，收集上清液，于          PCR 扩增。PCR 体系（25 μL）包括 cDNA 模板 2.0 μL，
          －80 ℃下保存，备用。最后，剖取、分离各组大鼠肺脏，                        2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL，正、反向引物各 1.0 μL，去
          取一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色观                          离子水 8.5 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性 5 min；
          察及免疫组化染色检测；余下部分经液氮快速冷冻后，                           94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共
          于－80 ℃下保存，备用。                                      30 个循环；最后，72 ℃终延伸 5 min。以 GAPDH 为内
          2.5 血清炎症指标检测                                       参，采用 2   －ΔΔCt  法计算 NF-κB、NLRP3、caspase-1 mRNA
              取各组大鼠血清样品适量，采用ELISA法检测其血                       的相对表达量，结果以正常组为参照进行归一化处理。
          清中 IL-1β、IL-18 水平，严格按照相应试剂盒说明书                     PCR引物序列及产物大小见表1。
          操作。                                                          表1 PCR引物序列及产物大小
          2.6 BALF中炎症细胞百分比检测                                  目的基因       方向              序列           产物大小/bp
              取各组大鼠 BALF 适量，用磷酸盐缓冲液（PBS）重                     NF-κB      正向      5′-ACCTGCCTCCTATGTCTTCCATCC-3′  239
          悬；取上述悬液0.1 μL，置于载玻片上，经晾干、涂片、固                                  反向      5′-CACTGAGTACACGTCGTCCACAC-3′
                                                              NLRP3      正向      5′-CTCGTCACCATGGGTTCTGGT-3′  146
          定后，进行瑞氏-吉姆萨染色，使用显微镜观察并计算淋
                                                                         反向      5′-AACGGACACTCGTCATCTTCA-3′
          巴细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、中性粒细胞百分                            caspase-1  正向      5′-CGTCTTGCCCTCATTATC-3′  127
          比（某细胞百分比＝该细胞数/细胞总数×100%）。                                      反向      5′-CACCTCTTTCACCATCTC-3′
          2.7 肺组织病理观察                                         GAPDH      正向      5′-TCATGACCACAGTCCATGCC-3′  250
              收集各组大鼠经 4% 多聚甲醛溶液固定好的肺组                                    反向      5′-TTCTAGA CGGCAGGTCAGGT-3′
          织，用乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙，再经乙醇梯度脱水、                        2.10 统计学方法
          石蜡包埋后切片（厚约 5 μm）；取上述切片，进行 HE 染                         采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
          色，再以中性树胶封片，使用显微镜观察其肺组织病理                           料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
          变化。                                                步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。


          中国药房  2026年第37卷第2期                                                 China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 2    · 157 ·
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