Page 48 - 《中国药房》2025年23期
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          箱中备用。将制备好的血清以20%的体积比 （该体积                           裂解、离心取上清。按 ELISA 试剂盒说明书操作，采用
          比在维持细胞正常生理状态的同时，能充分体现药物的                            酶标仪检测细胞中LC3含量。实验重复3次。
          体外效应）加至细胞培养基中（即含药血清与 RPMI                           2.2.6 细胞中 Bax、Bcl-2、p-NF-κB p65、SNAIL 蛋白表
          1640 培养基的体积比为 1∶4），即得 17.2、68.8 g/kg 复方             达检测
          蜥蜴散的20%含药血清和20%正常大鼠血清。                                  采用 Western blot 法检测。将处于对数生长期的细
          2.2 复方蜥蜴散联合DDP对MKN45/DDP细胞的影响                       胞接种于10 cm培养皿中，每皿6×10 个细胞，按“2.2.1”
                                                                                              5
          2.2.1 分组与给药                                         项下方法分组、给药。干预24 h后，收集各组细胞，使用
              将 MKN45/DDP 细 胞 置 于 含 5  μmol/L  DDP 的          RIPA裂解液（含1%苯甲磺酰氟）提取细胞中总蛋白，使
          RPMI 1640 完全培养基中常规培养（37 ℃，5%CO2 ），以                 用 BCA 法测定总蛋白浓度。将蛋白变性后，上样进行
          维持其耐药表型。在此后的实验干预开始前2周，将细                            十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶电压 80
          胞更换至不含DDP的完全培养基中培养。实验过程中，                           V，分离胶电压 120 V），电泳结束后将蛋白湿转（温度
          将细胞分为模型组（20% 正常大鼠血清）、DDP 组[1.3                      4 ℃，电流300 mA，转膜时间1 h）至PVDF膜，用快速封
          μg/mL（根据前期CCK-8预实验结果确定的半数抑制浓                        闭液封闭 20 min；以 TBST 洗膜后，加入相应一抗（Bax、
          度）DDP+20%胎牛血清]、复方蜥蜴散低剂量含药血清+                        Bcl-2、p-NF-κB p65、SNAIL 的稀释比例均为 1∶1 000，
          DDP组（17.2 g/kg复方蜥蜴散的20%含药血清+1.3 μg/mL               β-actin 的稀释比例为 1∶5 000），4 ℃孵育过夜；次日用
          DDP）、复方蜥蜴散高剂量含药血清+DDP 组（68.8 g/kg                   TBST洗膜后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释
          复方蜥蜴散的20%含药血清+1.3 μg/mL DDP）。                       比例为1∶5 000），室温孵育2 h；用ECL化学发光试剂显
          2.2.2 细胞存活率检测                                       影，在超灵敏多功能成像仪下成像。采用 Image J 软件
              采用 CCK-8 法检测。将 MKN45/DDP 细胞接种于                  分析条带灰度值，以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）条带
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          96 孔板中，每孔 8×10 个细胞。待细胞贴壁后，按                         灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。实验重
         “2.2.1”项下方法分组（每组设置6个复孔）、给药，同时设                       复3次。
          置空白组（无细胞，不加药）。干预 24 h 后，每孔加入                        2.3 复方蜥蜴散联合DDP逆转细胞耐药的机制验证
          CCK-8 试剂 10 µL，在 37 ℃下孵育 1 h。采用酶标仪检                 2.3.1 分组与给药
          测各孔在450 nm波长处的吸光度（A），并计算细胞存活率。                          将 MKN45/DDP 细胞分为模型组（20% 正常大鼠血
                                                                                        [12]
          细胞存活率＝（A 加药组－A 空白组 ）/（A 模型组－A 空白组 ）×100%。           清）、TNF-α组（5 µmol/L TNF-α +20%胎牛血清）、复方
          2.2.3 细胞凋亡检测                                        蜥蜴散高剂量含药血清+DDP 组（68.8 g/kg 复方蜥蜴散
              采用 TUNEL 染色法检测。将处于对数生长期的                        的 20% 含药血清+1.3 μg/mL DDP）、复方蜥蜴散高剂量
          MKN45/DDP细胞消化成单细胞悬液后，接种在48孔板                        含药血清+DDP+TNF-α组（68.8 g/kg复方蜥蜴散的20%
          内，每孔1×10 个细胞，按“2.2.1”项下方法分组（每组设                     含药血清+1.3 μg/mL DDP+5 µmol/L TNF-α）。
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          置3个复孔）、给药。干预24 h后，常规进行TUNEL染色                       2.3.2 细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Bax蛋白表达检测
          及 DAPI 染色。随后在荧光显微镜下随机观察，对阳性                             采用 Western blot 法检测。将 MKN45/DDP 细胞按
          染色细胞（TUNEL 阳性细胞的细胞核被标记为明亮的                         “2.3.1”项下方法分组、给药。干预24 h后，收集细胞，按
          绿色荧光，DAPI阳性细胞的细胞核被标记为蓝色荧光）                         “2.2.6”项下方法操作，检测细胞中LC3及Bax蛋白的表
          进行计数，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率＝绿色荧光细                            达，并计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。其中，LC3、Bax、GAPDH
          胞数量/蓝色荧光细胞数量×100%。                                 （内参蛋白）一抗的稀释比例均为1∶1 000，HRP标记的山
          2.2.4 细胞自噬水平检测                                      羊抗兔IgG二抗的稀释比例为1∶5 000。实验重复3次。
              采用 MDC 法检测。将处于对数生长期的 MKN45/                     2.4 统计学方法
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          DDP 细 胞 接 种 于 6 孔 板 内 ，每 孔 2×10 个 细 胞 ，按                采用 SPSS 25.0 和 GraphPad Prism 8.0 软件进行实
         “2.2.1”项下方法分组（每组设置 3 个复孔）、给药。干预                      验数据分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单
          24 h 后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞 2～3 次，每孔加                    因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验水
          入 1 mL MDC 工作液，37 ℃避光孵育 30 min。吸出                   准α＝0.05。
          MDC染色液，使用Assay Buffer洗细胞3次，采用荧光显                    3 结果
          微镜（激发波长为 355 nm）观察自噬体（蓝色荧光）颗                        3.1 复方蜥蜴散联合DDP对耐药细胞存活的影响
          粒。使用 Image J 软件检测细胞自噬体荧光强度，荧光                           与模型组比较，DDP 组和复方蜥蜴散低、高剂量含
          强度越大表示细胞自噬水平越高。                                     药血清+DDP 组细胞存活率均显著降低（P＜0.05）；与
          2.2.5 细胞中LC3含量检测                                    DDP 组比较，复方蜥蜴散低、高剂量含药血清+DDP 组
              采 用 ELISA 法 检 测 。 将 处 于 对 数 生 长 期 的             细胞存活率均显著降低（P＜0.05），且复方蜥蜴散高剂
          MKN45/DDP细胞接种于6孔板中，每孔2×10 个细胞，                      量含药血清+DDP组细胞存活率显著低于复方蜥蜴散低
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          按“2.2.1”项下方法分组、给药。干预24 h后，收集细胞，                     剂量含药血清+DDP组（P＜0.05）。结果见表1。


          · 2926 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 23                            中国药房  2025年第36卷第23期
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