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2 方法                                               2.5.2 细胞划痕实验
          2.1 细胞培养                                               取对数生长期的 CNE-1 细胞，接种于培养皿中，待
              CNE-1 细胞使用含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链                 细胞铺满后，用无菌移液枪头在培养皿内垂直划线，然
          霉素双抗的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO₂恒温环境中                      后按“2.3.2”项下方法分组、处理，分别在干预0和24 h时
          培养。待细胞融合度为 70%～80% 时进行传代。选用                        使用显微镜观察并测量划痕宽度。依据公式计算细胞
          增殖活跃、状态稳定的对数生长期细胞进行后续实验。                           迁移率：细胞迁移率＝（0 h划痕宽度－24 h划痕宽度）/0
          2.2 SOP浓度筛选                                        h划痕宽度×100%。
              为筛选SOP对CNE-1细胞的有效抑制浓度，实验采                      2.6 细胞凋亡率检测
          用 96 孔板接种体系，每孔接种 10 000 个细胞，经 24 h 贴                   根据流式细胞术，收集“2.3.1”项下细胞，用 PBS 洗
          壁培养后，分别给予 6.25、12.5、25、50、100、200、400              涤2次，去除残留培养基和死细胞，加入胰酶消化，离心
                              [10]
          μmol/L梯度浓度的SOP 或等体积磷酸盐缓冲液（PBS）                     去除上清液，用预冷的 PBS 洗涤细胞，PBS 重悬细胞制
          干预处理 24 h，每个浓度设置 6 个复孔。采用 CCK-8 法                  成单细胞悬液，加入适量 Annexin Ⅴ-FITC 染液和 PI 染
          分析细胞存活率，并计算半数抑制浓度。                                 液，轻轻混匀后，室温下避光孵育15 min，使用流式细胞
          2.3 细胞分组与处理                                        仪检测细胞凋亡率。
          2.3.1 SOP对CNE-1细胞生物学行为的调控作用研究                      2.7 细胞中MAPK信号通路相关基因表达的检测
              将细胞分为空白组及SOP 低、中、高浓度组（SOP-L
                                                                 根 据 RT-qPCR 法 ，收 集“2.3.1”项 下 细 胞 ，加 入
          组、SOP-M 组、SOP-H 组，根据“3.1”项下结果设置浓度
                                                             TRIzol 试剂提取总 RNA，检测其纯度和浓度后，反转录
          分别为25、50、100 μmol/L），每组设置3个复孔。除空白
                                                             成cDNA，然后进行PCR扩增。以GAPDH为内参，采用
          组给予不含双抗的完全培养基外，其余各组分别给予相
                                                             2 －ΔΔCt  法 计 算 丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 激 酶（mitogen-
          应药液干预24 h，再进行后续实验。
                                                             activated  protein  kinase  kinase，MEK）、ERK1、ERK2、
          2.3.2 MAPK 信号通路在 SOP 调控 CNE-1 细胞生物学
                                                             JNK mRNA的表达水平。PCR引物由生工生物工程（上
          行为过程中的作用研究
                                                             海）股份有限公司设计、合成，引物序列及产物长度
              将细胞分为空白组、SOP 高浓度组（SOP-H 组）、
                                                             见表1。
          SOP高浓度联合p38抑制剂组（SOP-H+SB组）和SOP高
                                                                       表1 PCR引物序列及产物长度
          浓度联合 JNK 抑制剂组（SOP-H+SP 组），每组设置 3 个
                                                              基因         引物序列（5′→3′）                产物长度/bp
          复孔。空白组和 SOP-H 组按“2.3.1”项下方法处理；                      MEK        正向引物：CCCTTAGCTCATACGGAATGGAC  239
          SOP-H+SB 组 和 SOP-H+SP 组 先 给 予 终 浓 度 均 为 10                     反向引物：GAGCCAACCTGCAAAATCCAC
                                                              ERK1       正向引物：CATCAACATGAAGGCCCGAA    155
                                       [11]
          μmol/L 的相应抑制剂培养 2 h 后 ，再给予 SOP（100
                                                                         反向引物：CTTCCTCCACTGTGATCCGTT
          μmol/L）干预24 h，然后进行后续实验。                             ERK2       正向引物：ATCCCCATCACAAGAAGACCTG  187
          2.4 细胞侵袭能力检测                                                   反向引物：AGCCTGTTCTACTTCAATCCTCT
                                                              JNK        正向引物：ACACCACAGAAATCCCTAGAAG  134
              根据 Transwell 侵袭实验，将 Matrigel 胶与无血清                         反向引物：CACAGCATCTGATAGAGAAGGT
          DMEM 高糖培养基按 1︰8 体积比混合后均匀涂布于                         GAPDH      正向引物：CTTTGTCAAGCTCATTTCCTGG  133
                                                                         反向引物：TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC
          Transwell上室，在37 ℃下静置成胶后移除未凝固液体。
                                                             2.8 细胞中生物学行为和MAPK信号通路相关蛋白表
          收集“2.3.1”及“2.3.2”项下细胞，经消化、离心后调整密
                   5
          度为 2×10 个/mL。取细胞悬液 200 μL 加入 Transwell             达的检测
          上室，下室加入 700 μL 含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养                     根据 Western blot 法，收集“2.3.1”及“2.3.2”项下细
          基。24 h 后，用 4% 多聚甲醛室温固定下室侵袭的细胞                      胞，裂解后提取总蛋白，测定蛋白浓度后进行变性。取
          15 min，PBS 漂洗 2 次，0.1% 结晶紫染色 15 min，在倒置            变性蛋白，电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用 5%
          显微镜下随机选取5个视野统计侵袭细胞数，取平均值。                          脱 脂 奶 粉 封 闭 2  h 后 ，加 入 p-JNK、JNK、p-ERK1/2、
          2.5 细胞迁移能力检测                                       ERK1/2、p38、p-p38、Ki67、MMP-9、cleaved-caspase-3、
          2.5.1 Transwell迁移实验                                GAPDH、β-actin一抗（稀释比例分别为1∶5 000、1∶2 000、
              收集“2.3.1”项下细胞，除无需用 Matrigel 胶涂布                1∶4 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶1 000、1∶10 000、1∶1 000、
          Transwell上室外，其余步骤按“2.4”项下方法操作，在倒                   1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃下孵育过夜；次日加入
          置显微镜下随机选取 5 个视野统计迁移细胞数，取平                          相应二抗（稀释比例均为1∶5 000），室温下孵育2 h；使用
          均值。                                                ECL化学发光试剂显色，ChemiDoc型成像系统成像，用


          中国药房  2025年第36卷第18期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 18    · 2281 ·
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