Page 45 - 《中国药房》2025年17期
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完全培养基，每2～3 d换液1次，持续筛选7～10 d，直至                     行转染以上调 SOD1 和 SOD2 的表达（PLC/PRF/5-oe‐
          L-02-GFP 组、HLE-GFP 组、PLC/PRF/5-GFP 组细胞全部           SOD1 组和 PLC/PRF/5-oeSOD2 组），并使用质粒 pEN‐
          死亡，检测 AFP 表达的改变情况以验证感染效率。当                         TER 进行转染作为对照（PLC/PRF/5-pENTER 组），该对
          PLC/PRF/5-shAFP 组细胞中的 AFP 表达量低于 PLC/               照与目的质粒骨架完全一致，仅缺失SOD1/SOD2编码序
                                                                                                           TM
          PRF/5 组、PLC/PRF/5-ZsGreen 组，L-02-oeAFP 组、HLE-      列。管 A 按高糖 DMEM 培养基 125 μL、Lipofectamine
          oeAFP组细胞中的AFP表达量分别高于L-02组和L-02-                    3000 Transfection Reagent 7.50 μL配制转染复合物，管B
                                                                                                      TM
          GFP 组、HLE 组和 HLE-GFP 组，表明 AFP 表达改变成                按 高 糖 DMEM 培 养 基 125  μL、Lipofectamine   3000
          功，抗性克隆继续扩大培养，建立稳定表达株。再以                            Transfection Reagent 3.75 μL配制转染复合物，将上述试
          Western blot 法（检测同“2.2.1”项下，以 GAPDH 为内参）           剂轻柔混匀，室温孵育5 min。另取无菌微量离心管，配
          检测各组细胞中SOD1、SOD2的表达，以SOD活性检测                       制 DNA 稀释液：质粒 DNA 5 μg、高糖 DMEM 培养基
                                                                                 TM
          试剂盒（检测同“2.2.2”项下）检测各组细胞中的 SOD 活                    250  μL、Lipofectamine   3000  Transfection  Reagent  10
          性。上述实验重复3次。                                        μL，轻柔混匀后，室温孵育 5 min。将 DNA 稀释液等体
          2.4 SOD给药对PLC/PRF/5细胞恶性生物学行为影响                     积分成 2 份，分别加入管 A 与管 B 中，轻轻混匀，室温静
          的检测                                                置10～15 min，形成 DNA-脂质复合物。转染前，将6孔
          2.4.1 细胞迁移能力检测                                     板中的培养基更换为每孔 1.5 mL 的完全培养基（含血
              采用细胞划痕实验检测。取“2.1”项下处于对数生                       清）。将上述 2 组 DNA-脂质复合物分别均匀滴加至对
          长期的 PLC/PRF/5 细胞，按照每孔 5×10 个接种于 6 孔                应孔中，轻轻摇匀。将细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中
                                            5
          板中，于细胞培养箱（37 ℃，10%CO2 ）中培养至细胞汇合                    继续培养。转染 6 h 后，可根据细胞状态更换为完全培
          率大于90%，使用10 μL枪头沿孔底中线轻轻制造划痕；                       养基；转染 48～72 h 后，收集细胞进行转染效率分析。
          各孔分别加入终浓度为0（对照）、0.188、0.375、0.75、1.5、              当 PLC/PRF/5-oeSOD1 组的 SOD1 表达量和 PLC/PRF/5-
          3 U/mL的SOD（浓度依据前期预实验结果得出，下同），                      oeSOD2 组的 SOD2 表达量均高于 PLC/PRF/5 组和 PLC/
          每个给药浓度设置2个复孔，放置于细胞培养箱中，并于                          PRF/5-pENTER 组，表明 PLC/PRF/5-oeSOD1 组和 PLC/
          0、24、48、72 h 时对划痕愈合情况进行拍照记录。使用                     PRF/5-oeSOD2 组 SOD 表达上调成功。再采用 Western
          Image J软件进行愈合面积分析并计算细胞划痕愈合率。                       blot 法（检测同“2.2.1”项下，以 β-actin 为内参）检测上调
          细胞划痕愈合率（%）＝（0 h时划痕面积－不同时间点划                        SOD1、SOD2 表达后细胞中恶性生物学行为相关蛋白
          痕面积）/0 h时划痕面积×100%。上述实验重复3次。                       AFP、Src的表达。上述实验重复3次。
          2.4.2 细胞增殖能力检测                                     2.6 统计学分析
              采用CCK-8实验检测。取“2.1”项下处于对数生长                         采用 GraphPad Prism 9.5 软件进行统计分析。计量
                                         3
          期的 PLC/PRF/5 细胞按照每孔 2×10 个接种于 96 孔板                资料满足正态分布以x±s表示，多组间比较采用单因素
          中，于细胞培养箱（37 ℃，10%CO2 ）中培养至细胞汇合率                    方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
          约为 60%；各孔分别加入终浓度为 0（对照）、0.188、                     α＝0.05。
          0.375、0.75、1.5、3 U/mL 的 SOD，每个给药浓度设置 5 个           3 结果
          复孔，放置于细胞培养箱48 h后，每孔加入100 μL高糖                      3.1 L-02、HLE、PLC/PRF/5 细胞中 SOD 表达及 SOD
          DMEM培养基和10 μL CCK-8试剂。细胞培养箱孵育，                     活性检测结果
          从孵育后 15 min 开始，每 15 min 用酶标仪测定 450 nm                  Western blot检测结果（图1）显示，与L-02组和HLE
          波长处的A值，根据A值最佳读值范围，选取各孔读值在                          组比较，PLC/PRF/5 组细胞中的 SOD1、SOD2 表达量均
          0.6～1.0 时间点的数值计算细胞增殖率（细胞增殖率＝                       显著降低（P＜0.05）。此外，L-02 组和 HLE 组中未检测
          A 给药/A 对照×100%）。上述实验重复3次。                          出AFP，PLC/PRF/5组中有AFP表达。
          2.5 上调SOD表达后PLC/PRF/5细胞恶性生物学行为                         SOD 活性检测结果显示，PLC/PRF/5 组细胞中的
          相关蛋白AFP、Src表达的检测                                   SOD 活性[（0.05±0.01）U/50 μg 总蛋白]较 L-02 组和
            采用瞬时表达质粒转染上调 PLC/PRF/5 细胞中的                      HLE 组 细 胞 中 的 SOD 活 性 [ 分 别 为（0.11±0.02）、
          SOD 表达。取“2.1”项下处于对数生长期的 PLC/PRF/5                 （0.11±0.01））U/50  μg 总 蛋 白] 显 著 降 低（P＜0.05，
                              5
          细胞，按照每孔 2.5×10 个接种于 6 孔板中，每孔加入 2                   n＝3）。
          mL 的完全培养基，置于 37 ℃、5%CO₂培养箱中培养                      3.2 改变 AFP 表达对 L-02、HLE、PLC/PRF/5 细胞中
          18～24 h，至细胞汇合率为 70%～90% 即可进行瞬时表                    SOD表达及SOD活性的影响
          达质粒转染。PLC/PRF/5 细胞使用 SOD1 过表达质粒                        Western blot 检测结果（图 2）显示，下调 PLC/PRF/5
          pENTER-SOD1 和 SOD2 过表达质粒 pENTER-SOD2 进             细胞中的 AFP 表达后，与 PLC/PRF/5 组比较，PLC/PRF/


          中国药房  2025年第36卷第17期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 17    · 2123 ·
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