Page 44 - 《中国药房》2025年17期
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抗 AFP 小 鼠 单 克 隆 抗 体 、抗 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶          再用2倍体积的完全培养基终止消化，得细胞悬液用于
         （GAPDH）小鼠单克隆抗体、抗 SOD1 小鼠单克隆抗体、                       后续实验。
          抗SOD2小鼠单克隆抗体、嘌呤霉素盐酸盐（批号分别为                          2.2 L-02、HLE、PLC/PRF/5 细胞中 AFP 和 SOD 表达
          E674004、C510003、C503031、E606335-0500、C691103-       及SOD活性检测
          0001、C510053-0020、C520003-0001、D799593-0050、        2.2.1 AFP和SOD表达的检测
          D110058-0025、D110065-0100、D110098-0100、D110087-         AFP、SOD 表 达 采 用 Western  blot 法 检 测 。 根 据
          0025、D199611-0100、D190090-0200、D199859-0100、 “2.1”项下方法进行分组和细胞培养。使用动物全蛋白
          D199597-0100、A610593-0025）均购自生工生物工程（上               提取试剂盒提取各组细胞全蛋白，采用Bradford法检测
          海）股份有限公司；抗兔肉瘤病毒蛋白（sarcoma virus                     全蛋白浓度，用裂解液将不同细胞全蛋白浓度调整至同
          protein，Src）单克隆抗体（批号 AB109381）购自英国                  一水平后，加入蛋白上样缓冲液，并在 100 ℃下将蛋白
          Abcam 公司；带有 ZsGreen 标签的干扰 AFP 表达的慢病                 变性 10 min。使用 Bis-Tris 预制胶以 120 V 恒定电压进
          毒（滴度 2.0×10  TU/mL）及其对照（仅为带 ZsGreen 标               行电泳，冰浴下以 150 mA 恒定电流进行转膜，5% 脱脂
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          签 的 慢 病 毒 ，滴 度 1.5×10   TU/mL）（批 号 分 别 为            奶粉室温封闭2 h，加入AFP、SOD1、SOD2一抗（稀释度
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          HH20231109HKZX-LV01、HH20231109HKZX-NC）均购            均为1∶1 000），4 ℃摇床孵育过夜（14～18 h）；加入二抗
          自汉恒生物科技（上海）有限公司；带有绿色荧光蛋白                           （稀释度为 1∶1 000），37 ℃摇床孵育 1 h；于膜上滴加
         （green fluorescent protein，GFP）标签的过表达 AFP 的慢         ECL化学发光底物试剂，显影，采用Image J软件进行分
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          病毒（滴度2.5×10  TU/mL）及其对照（仅为带有GFP标                    析，以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值
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          签的慢病毒，滴度 3.5×10  TU/mL）（批号分别为 LV-                   表示目标蛋白的相对表达量。上述实验重复3次。
          AFP22678-1、LV-CON335）均购自上海吉凯基因医学科                   2.2.2 SOD活性检测
          技股份有限公司；SOD1 过表达质粒 pENTER-SOD1 和                        根据“2.1”项下方法进行分组和细胞培养。每毫升
          SOD2 过 表 达 质 粒 pENTER-SOD2（ 批 号 分 别 为               提取液细胞用量为5×10 个，使用酶标仪测定560 nm波
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          NM000454、NM000636）均购自美国 Vigene Biosciences          长处的吸光度（A）值，并计算 SOD 活性（U/50 μg 总蛋
          公司；ECL 化学发光底物试剂盒（批号 BL520A）购自合                      白）。具体操作按照 SOD 活性检测试剂盒说明书进行。
          肥白鲨生物科技有限公司；PageRulerᵀᴹ 预染蛋白分子                      上述实验重复3次。
                               TM
          量标准品、Lipofectamine  3000 Transfection Reagent（批     2.3 改变 AFP 表达后 L-02、HLE、PLC/PRF/5 细胞中
          号分别为 26616、3219327）均购自美国 Thermo Fisher              AFP和SOD表达及SOD活性检测
          Scientific公司；胎牛血清（批号11011-8611）购自浙江天                    采用慢病毒感染改变各细胞中 AFP 的表达。慢病
          杭生物科技股份有限公司；磷酸盐缓冲液为实验室                              毒感染前 18～24 h，将处于对数生长期的 L-02、HLE 及
          自配。                                                 PLC/PRF/5细胞以每孔2.5×10 个接种于6孔板中，次日
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          1.3 实验细胞                                            细胞汇合率达 30%～40% 时即可进行慢病毒感染。L-
              人 正 常 肝 细 胞 L-02（AFP 表 达 阴 性 ，批 号 SNL-          02和HLE细胞使用带有GFP标签的过表达AFP的慢病
          141）、AFP 表达阴性的人肝癌细胞 HLE（批号 SNL-702）                 毒 感 染 以 上 调 AFP 的 表 达（L-02-oeAFP 组 和 HLE-
          均购自武汉尚恩生物技术有限公司，AFP表达阳性的人                           oeAFP 组），并使用仅带有 GFP 标签的慢病毒作为对照
          肝癌细胞 PLC/PRF/5（批号 TCHu119）购自中国科学院                   以排除后续实验中慢病毒的干扰（L-02-GFP 组和 HLE-
          细胞库。                                                GFP组）；PLC/PRF/5细胞使用带有ZsGreen标签的干扰
          2 方法                                                AFP 表 达 的 慢 病 毒 以 下 调 AFP 的 表 达（PLC/PRF/5-
          2.1 分组与细胞培养                                         shAFP组），并使用仅带有ZsGreen标签的慢病毒作为对
              实验分为人正常肝细胞L-02组（L-02组）、AFP表达                    照以排除后续实验中慢病毒的干扰（PLC/PRF/5-Zs‐
          阴性的人肝癌细胞HLE组（HLE组）、AFP表达阳性的人                        Green 组）。依据预实验测定的各细胞系最适感染复数
          肝癌细胞PLC/PRF/5组（PLC/PRF/5组）。将冻存于液氮                  （multiplicity of infection，MOI），按公式计算病毒体积：
          中的L-02、HLE、PLC/PRF/5细胞于37 ℃水浴解冻后，以                  病毒体积（μL）＝细胞数×MOI/病毒滴度（TU/mL）×
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          800 r/min离心5 min。吸弃上清液后，用1 mL含10%胎                  10 。其中，L-02 细胞的 MOI＝5，HLE 细胞的 MOI＝8，
          牛血清、1% 青霉素-链霉素溶液的高糖 DMEM 培养基                        PLC/PRF/5 细胞的 MOI＝10。弃去原培养基，用磷酸盐
         （以下简称“完全培养基”）重悬细胞，移至细胞培养瓶后                           缓冲液清洗1次，加入各病毒混合液，37 ℃孵育6 h后补
          加完全培养基至 5 mL，混匀后，于 37 ℃、饱和湿度、5%                     加等体积完全培养基。继续培养48 h，荧光显微镜下观
          CO2培养箱中培养至细胞汇合率为80%～90%。需传代                         察 ZsGreen 或 GFP 的绿色荧光阳性率，确认感染效率＞
          或铺板操作的细胞用 1 mL 胰酶细胞消化液消化洗脱，                         80%。感染 72 h 后，更换含 2 μg/mL 嘌呤霉素盐酸盐的


          · 2122 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 17                            中国药房  2025年第36卷第17期
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