Page 72 - 《中国药房》2025年16期
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到聚偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂牛奶封闭膜 2 h，然后                       3 结果
          与PCNA、p53、B7H1、PD-1、cGAS、STING、GAPDH抗体              3.1 柚皮苷调控 cGAS-STING 信号通路对 MDA-MB-
         （稀释比例分别为 1∶3 000、1∶5 000、1∶7 000、1∶5 000、            231细胞增殖、凋亡的影响
          1∶6 000、1∶3 000、1∶4 000）在4 ℃下孵育过夜。次日，用              3.1.1 细胞增殖变化
          TBST缓冲液清洗3次后，加入二抗（稀释比例1∶4 000），                         与空白组比较，柚皮苷低、中、高剂量组 MDA-MB-
          在室温下孵育1 h；以ECL试剂曝光、显影后，使用Image                      231细胞的EdU阳性率和OD450值均显著降低，且呈剂量
          J 软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白与内参蛋白                            依赖性（P＜0.05）；而RU.521组的EdU阳性率和OD450值
                                                              均显著升高（P＜0.05）。与柚皮苷高剂量组比较，柚皮
         （GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
                                                              苷高剂量+RU.521 组 MDA-MB-231 细胞的 EdU 阳性率
          2.2 柚皮苷调控 cGAS-STING 信号通路对 MDA-MB-
          231细胞免疫逃逸的影响                                        和OD450值均显著升高（P＜0.05），结果见图1和表1。
          2.2.1 细胞分组与干预
              利用 Transwell 小室将“2.1.1”项下各组 MDA-MB-
          231 细胞分别与 NK 细胞共孵育 48 h（MDA-MB-231 细
          胞和 NK 细胞分别置于 Transwell 小室的上、下室，细胞
                                                                   A.空白组        B.柚皮苷低剂量组       C.柚皮苷中剂量组
                          4
          密度分别为 5×10 、5×10 个/小室），并依次命名为空
                                 5
          白+NK 组、柚皮苷低剂量+NK 组、柚皮苷中剂量+NK
          组、柚皮苷高剂量+NK 组、RU.521+NK 组、柚皮苷高剂
          量+RU.521+NK 组。除空白+NK 组的 MDA-MB-231 细
          胞直接与 NK 细胞共孵育 48 h 外，其他各组的 MDA-                       D.柚皮苷高剂量组         E.RU.521组  F.柚皮苷高剂量+RU.521组
                                                                 红色荧光：活跃增殖的细胞；蓝色荧光：总细胞核。
          MB-231 细胞需要先经过药物预处理 48 h 后再与 NK 细
                                                              图1 各组MDA-MB-231细胞的增殖检测荧光图（EdU
          胞共孵育 48 h。每组设置 6 个复孔，处理结束后检测相
                                                                   染色）
          应指标。
                                                              表1 各组 MDA-MB-231 细胞的 EdU 阳性率、OD450值
          2.2.2 共孵育体系上清液中颗粒酶 B、TNF-α、IFN-γ 水
                                                                   和细胞凋亡率比较（x±s，n＝6）
          平的检测
                                                              组别              EdU阳性率/%     OD 450值  细胞凋亡率/%
              收集“2.2.1”项下各组共孵育体系中的上清液，按照
                                                              空白组             32.89±1.56  1.16±0.09  5.88±0.15
          ELISA 试剂盒说明书操作，检测其中颗粒酶 B、TNF-α、                     柚皮苷低剂量组         27.73±1.25 a  1.01±0.08 a  9.23±0.41 a
          IFN-γ的水平。                                           柚皮苷中剂量组         20.55±0.97 ab  0.84±0.08 ab  17.63±0.82 ab
                                                              柚皮苷高剂量组         12.68±0.71 abc  0.46±0.04 abc  29.65±1.43 abc
          2.2.3 共孵育体系中NK细胞杀伤力的检测
                                                              RU.521组         38.44±1.71 a  1.39±0.12 a  2.11±0.10 a
              按“2.2.1”项下方法将各组 MDA-MB-231 细胞、NK                柚皮苷高剂量+RU.521组  21.22±0.98 d  0.81±0.07 d  14.56±0.69 d
          细胞共孵育 48 h 后，离心收集 50 μL 上清液，置于新的                       a：与空白组比较，P＜0.05；b：与柚皮苷低剂量组比较，P＜0.05；c：
          96 孔板中，每孔加入 50 μL 乳酸脱氢酶孵育 30 min，再                  与柚皮苷中剂量组比较，P＜0.05；d：与柚皮苷高剂量组比较，P＜0.05。
          加入50 μL终止液终止反应1 h，使用酶标仪检测450 nm                     3.1.2 细胞凋亡变化
          波长处的光密度（OD450 ）值。此外，分别将 MDA-MB-                         与空白组比较，柚皮苷低、中、高剂量组 MDA-MB-
                        4
                                           5
          231 细胞（5×10 个）、NK 细胞（5×10 个）、MDA-MB-                231 细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05），而 RU.521 组细
                        4
          231 细胞（5×10 个，用 10 μL 30%Triton X-100 干预处           胞凋亡率显著降低（P＜0.05）；与柚皮苷高剂量组比较，
          理）接种于96孔板中孵育48 h，离心收集50 μL上清液，                      柚皮苷高剂量+RU.521 组 MDA-MB-231 细胞凋亡率显
                                                              著降低（P＜0.05），结果见图2和表1。
          置于新的 96 孔板中，每孔加入 50 μL 乳酸脱氢酶孵育
                                                              3.1.3 细胞中 PCNA、p53、B7H1、PD-1、cGAS、STING
          30 min，再加入 50 μL 终止液终止反应 1 h 后，检测其
                                                              蛋白表达变化
          OD450值。按下式计算 NK 细胞杀伤力，NK 细胞杀伤力
                                                                  与空白组比较，柚皮苷低、中、高剂量组 MDA-MB-
         （%）＝（实验组 OD450值－MDA-MB-231 细胞单独培养                    231 细胞中 PCNA、B7H1、PD-1 蛋白表达水平均显著降
          的 OD450值－NK 细胞单独培养的 OD450值）/（MDA-MB-
                                                              低，p53、cGAS、STING 蛋白表达水平均显著升高，且上
          231 细胞在 10 μL 30%Triton X-100 中孵育时的 OD450
                                                              述变化呈剂量依赖性（P＜0.05）；而 RU.521 组细胞中
          值－MDA-MB-231细胞单独培养的OD450值）×100%。                    PCNA、B7H1、PD-1 蛋白表达水平均显著升高，p53、
          2.3 统计学分析                                           cGAS、STING 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。与
              采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量               柚皮苷高剂量组比较，柚皮苷高剂量+RU.521 组 MDA-
          数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进                         MB-231 细胞中 PCNA、B7H1、PD-1 蛋白表达水平均显
          一步两两比较采用 SNK-q 多重比较检验。检验水准                          著升高，p53、cGAS、STING 蛋白表达水平均显著降低
          α＝0.05。                                            （P＜0.05）。结果见图3和表2。


          · 2014 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 16                            中国药房  2025年第36卷第16期
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