Page 71 - 《中国药房》2025年16期

乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，其发病率在 因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ 干扰素（inter‐
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我国女性恶性肿瘤中排名第一，并且逐年上升 。目前， feron-γ，IFN-γ）酶联免疫吸附分析试剂盒（批号分别为
乳腺癌的疗法多样，包括药物治疗、手术治疗、放射治疗 20231105、20231109、20231226）均购自上海瓦兰生物科
等。尽管乳腺癌的治疗已取得了巨大进步，但现有疗法 技有限公司。
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在改善乳腺癌患者预后方面的效果仍然有限 。据报 1.3 细胞
道，不受控制的细胞增殖以及凋亡抑制是促进乳腺癌进 人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 购自中国科学院细
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展的主要原因之一 ，免疫逃逸是乳腺癌恶性发展的关 胞库/干细胞库；人外周血自然杀伤（natural killer，NK）
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键过程 。因此，开发药物抑制肿瘤细胞增殖和免疫逃 细胞购自汇智和源生物技术（苏州）有限公司。
逸，诱导肿瘤细胞凋亡，对于乳腺癌的治疗意义重大。 2 方法
柚皮苷是一种主要存在于芸香科柑橘类水果中的 2.1 柚皮苷及cGAS-STING信号通路对MDA-MB-231
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天然二氢黄酮，具有抗肿瘤活性 。已有研究报道，柚皮 细胞增殖、凋亡的影响
[6]
苷可抑制乳腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡 。但关于柚 2.1.1 MDA-MB-231细胞的分组与处理
皮苷是否对乳腺癌细胞免疫逃逸也有影响尚未可知。 将 MDA-MB-231 细胞接种于含 10% 胎牛血清和
已有研究表明，激活环鸟苷酸-腺苷酸合酶（cyclic GMP- 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中，置于 37 ℃、
AMP synthase，cGAS）-干扰素基因刺激因子（stimulator 5%CO2培养箱中培养。取对数生长期的 MDA-MB-231
of interferon gene，STING）信号通路可通过增强机体的 细胞，以1×10 个/孔的密度接种于96孔板中，分为空白
5
[7]
抗肿瘤免疫力，抑制乳腺癌进展 ；还有研究表明，柚皮 组、柚皮苷低剂量组、柚皮苷中剂量组、柚皮苷高剂量
苷可通过失活 cGAS-STING 信号通路改善缺血再灌注 组、RU.521组、柚皮苷高剂量+RU.521组，每组设置6个
损伤大鼠的肠损伤，减轻炎症反应和氧化应激，抑制肠 复孔。空白组MDA-MB-231细胞正常培养48 h；柚皮苷
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细胞凋亡 。基于此，本研究基于 cGAS-STING 信号通 低、中、高剂量组MDA-MB-231细胞分别用50、100、200
[6]
路，探究了柚皮苷对乳腺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸 μmol/L柚皮苷处理48 h ；RU.521组MDA-MB-231细胞
的影响，旨在为乳腺癌的治疗提供参考依据。 用 1 μmol/L RU.521 处理 48 h ；柚皮苷高剂量+RU.521
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1 材料 组 MDA-MB-231 细胞用 200 μmol/L 柚皮苷和 1 μmol/L
1.1 主要仪器 RU.521共同处理48 h，处理结束后检测相应指标。
本研究所用主要仪器包括 BX53 型荧光显微镜（日 2.1.2 MDA-MB-231细胞增殖的检测
本 Olympus 公 司）、SpectraMax iD5 型 酶 标 仪（美 国 采用 EdU 细胞增殖检测法。收集“2.1.1”项下处理
Molecular Devices 公司），FACS Celesta 型流式细胞仪 后的各组细胞，分别与50 μmol/L EdU共孵育2 h；用4%
（美国 BD 公司），Mini-PROTEAN Tetra 型蛋白电泳仪 多聚甲醛固定细胞 30 min 后，用 2 mg/mL 甘氨酸中和，
（美国Bio-Rad公司）。 然后用 0.5%Triton X-100 透化细胞；随后，使用 4′，6-二
1.2 主要药品与试剂 脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。使用荧光
柚皮苷对照品（纯度≥98%，批号 Y-006）购自成都 显微镜获得细胞图像，并计算 EdU 阳性率，EdU 阳性
瑞芬思生物科技有限公司；cGAS 抑制剂 RU.521（纯度 率＝EdU阳性细胞数/DAPI阳性细胞总数×100%。
99.95%，批号 HY-114180）购自美国 MCE 公司；5-乙炔 采用CCK-8法。按“2.1.1”项下方法分组、处理细胞
基-2′-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU） 后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，使用酶标仪检
染色试剂盒（批号C0081L）购自上海碧云天生物技术股 测450 nm波长处的光密度（optical density，OD）。
份有限公司；CCK-8 试剂盒（批号 C0038）购自广州研创 2.1.3 MDA-MB-231细胞凋亡的检测
生物技术发展有限公司；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素 收集“2.1.1”项下处理后的各组细胞，用胰酶消化后
6
（annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC）/ 调整细胞密度为 1×10 个/mL，利用结合缓冲液重悬细
碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒（批 胞后，每管加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI溶液，稍
号 KGA1026）购自江苏凯基生物技术股份有限公司；兔 加混匀后室温避光孵育10 min，使用流式细胞仪检测细
+
+
源 增 殖 细 胞 核 抗 原（proliferating cell nuclear antigen， 胞凋亡情况，凋亡率＝（Annexin Ⅴ /PI 细胞数+Annexin
+
－
PCNA）、p53、B7同源物1（B7 homolog 1，B7H1）、程序性 Ⅴ /PI 细胞数）/总细胞数×100%（“+”为阳性，“－”为
死亡受体 1（programmed death-1，PD-1）、cGAS、STING、 阴性）。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy‐ 2.1.4 MDA-MB-231 细胞中 PCNA、p53、B7H1、PD-1、
drogenase，GAPDH）抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊 cGAS、STING蛋白表达的检测
抗兔免疫球蛋白G二抗（批号分别为ab92552、ab32389、 采用 Western blot 法。收集“2.1.1”项下处理后的各
ab205921、ab213480、ab224245、ab198951、ab181602、 组细胞，使用预冷的 RIPA 缓冲液提取细胞总蛋白，用
ab6721）均购自英国Abcam公司；人颗粒酶B、肿瘤坏死 BCA 法测定蛋白浓度。将 40 μg 蛋白进行电泳后转移

中国药房 2025年第36卷第16期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 16 · 2013 ·