Page 49 - 《中国药房》2025年12期
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10 mL 中；将上述 2 种溶液混匀，乳化 1 min，形成油相。                 累积释放量并绘制释放曲线。计算公式为：累积释放
          将油相加入到 3%PVA 溶液 5 mL 中，得油包水乳液；乳                               n－1
                                                                   c nV 0+  ∑
          化 1 min 后，加入 2% 异丙醇溶液 20 mL，于室温下振荡                 量＝         i＝1  c iV i  ×100%（式中，cn为第n个时间点样
          3～5 h，使有机溶剂充分挥发，得TP@PLGA-PEG-FA乳                             m
          液。上述乳液经15 000 r/min离心10 min，弃去上清液，                 品的质量浓度；V0为溶出介质总体积；ci为第 i 个时间点
          沉淀用水重悬并重复洗涤 3 次，以去除未包封的 TP；再                       样品的质量浓度；V i为取样体积；m 为纳米粒子中 TP 含
          用水重悬后，于4 ℃下保存，备用。                                  量）。实验重复3次。
                                                             2.5 TP@PLGA-PEG-FA的血液相容性考察
              使用同样方法制备PLGA-PEG空白纳米粒子（不加
                                                                 取经抗凝处理的健康大鼠外周血适量，加入生理盐
          TP，将 PLGA-PEG-FA 替换为 PLGA-PEG）、PLGA-PEG-
                                                             水，以 3 000 r/min 离心 10 min 至上清液无色，收集红细
          FA 空白靶向纳米粒子（不加 TP）、TP@PLGA-PEG（将
                                                             胞并用生理盐水重悬；将 TP 不同质量浓度（400、300、
          PLGA-PEG-FA 替换为 PLGA-PEG）、Cy3.5@PLGA-PEG
                                                             200、100 µg/mL）的TP@PLGA-PEG-FA与等体积的红细
         （将 TP 替 换 为 Cy3.5，PLGA-PEG-FA 替 换 为 PLGA-
                                                             胞悬液混匀，即得供试样品。另设阳性对照样品（以水
          PEG）、Cy3.5@PLGA-PEG-FA（将TP替换为Cy3.5）。
                                                             混合红细胞悬液）和阴性对照样品（以生理盐水混合红
          2.2 TP@PLGA-PEG-FA的表征
                                                             细胞悬液）。所有样品于 37 ℃下放置 2 h 后，以 3 000
              取“2.1”项 下 TP@PLGA-PEG-FA、PLGA-PEG-FA
                                                             r/min 离心 10 min，取上清液，使用紫外分光光度计于
          空白靶向纳米粒子适量，使用扫描电子显微镜观察其形
                                                             541 nm 波长处检测其吸光度值，再计算各样品的溶血
          态及分布。取“2.1”项下TP@PLGA-PEG-FA、TP@PLGA-
                                                             率：溶血率（%）＝（待测样品的吸光度值－阴性对照样
          PEG 适量，使用激光粒度分析仪检测其粒径、Zeta 电位
                                                             品的吸光度值）/（阳性对照样品的吸光度值－阴性对照
          及 多 分 散 性 指 数（polydispersity  index，PDI），检 测 重
                                                             样品的吸光度值）×100%。
          复3次。
                                                             2.6 TP@PLGA-PEG-FA的稳定性考察
          2.3 TP@PLGA-PEG-FA载药量和包封率的测定
                                                                 取“2.1”项下 TP@PLGA-PEG-FA 适量，于 4 ℃水中
              精密称取TP对照品，用甲醇稀释，制成质量浓度分
                                                             放置 14 d，每隔 2 d 取样 1 次；另将 TP@PLGA-PEG-FA
          别为 30、20、10、5、2.5 μg/mL 的标准溶液。以甲醇为对
                                                             置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃下放
          照，使用紫外分光光度计于 217 nm 波长处检测上述 TP
                                                             置12 h，每隔2 h取样1次。使用激光粒度分析仪检测其
          标准溶液的吸光度值并记录其紫外光谱图。以吸光度
                                                             粒径、PDI、Zeta电位，以评价纳米粒子的稳定性。
          值为纵坐标、对应 TP 标准溶液的质量浓度为横坐标绘
                                                             2.7 RAW264.7细胞对纳米粒子的摄取情况考察
          制标准曲线，并进行方法学考察。
                                                                 TP@PLGA-PEG-FA和TP@PLGA-PEG中没有发光
              取“2.1”项 下 TP@PLGA-PEG-FA、PLGA-PEG-FA
                                                             成分，为考察纳米粒子表面耦联 FA 是否会提高纳米粒
          空白靶向纳米粒子各 1 mL，分别用水 10 mL稀释，以 30                   子的靶向性，本研究将纳米粒子中装载的 TP 替换为荧
          μg/mL 的 TP 标准溶液为对照，使用紫外分光光度计于                      光染料 Cy3.5，用以考察 RAW264.7 细胞对纳米粒子的
          217 nm 波长处检测样品溶液的吸光度值并记录其紫外                                                            5
                                                             摄取情况。取 RAW264.7 细胞，以 1×10 个/孔接种到
          光谱图，再根据前述所得回归方程计算纳米粒子中 TP                          24 孔共聚焦培养板中，待完全贴壁后，将其分为激活
          含量，根据下式计算 TP@PLGA-PEG-FA 的载药量和包                    细胞（以 1 μg/mL 的脂多糖刺激 24 h）和未激活细胞，
          封率：载药量（%）＝纳米粒子中 TP 含量/纳米粒子的总                       分 别 用 含 Cy3.5@PLGA-PEG、Cy3.5@PLGA-PEG-FA+
          质量×100%；包封率（%）＝纳米粒子中TP含量/TP总投                      游离 FA、Cy3.5@PLGA-PEG-FA（Cy3.5 质量浓度均为
          入量×100%。实验重复3次。                                    500  ng/mL）的 RPMI-1640 培养基孵育 2 h（每组设置 3
          2.4 TP@PLGA-PEG-FA的体外释药实验                          个复孔）；收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤3次；加入4%
              取“2.1”项下 TP@PLGA-PEG-FA 溶液 3 份，各 1 mL          多聚甲醛溶液固定30～40 min，再用磷酸盐缓冲液洗涤
         （其中 TP 质量浓度相同），置于透析袋（截留分子量 300                      3次；加入DAPI染液染色5 min，使用激光共聚焦显微镜
          kDa）中，再分别浸入装有 pH7.4、6.5、5.5 磷酸盐缓冲液                 观察细胞对纳米粒子的摄取情况（细胞核经 DAPI 染色
         （pH 参考文献[11]设置）50 mL的离心管中，将离心管置                     后呈蓝色荧光，而 Cy3.5@PLGA-PEG 和 Cy3.5@PLGA-
          于37 ℃摇床中均匀振荡。分别于0、4、8、10、12、16、24、                 PEG-FA呈红色荧光），并拍照记录。
          30、36、42、48、50、60、72 h时从离心管中取样5 mL，同时              2.8 TP@PLGA-PEG-FA的体外细胞毒性考察
                                                                                                     4
          补加等pH等温等体积的磷酸盐缓冲液。使用紫外分光                               取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×10 个/孔接
          光度计于 217 nm波长处检测各时间点取样溶液的吸光                        种到96孔板中，待完全贴壁后，将其分为激活细胞（以1
          度值，代入“2.3”项下回归方程计算 TP 含量，计算 TP 的                   μg/mL的脂多糖刺激24 h）和未激活细胞，用含8%胎牛


          中国药房  2025年第36卷第12期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 12    · 1459 ·
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