Page 60 - 《中国药房》2025年6期
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电图异常（频率＞20 Hz或波幅＞80 μV），即表示难治性                      15 min），取上清，采用 BCA 法测定上清液中的蛋白浓
                          [8]
          癫痫大鼠造模成功 。在筛选过程中，10 只大鼠死亡，8                         度。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分
          只大鼠造模失败，最终获得62只难治性癫痫大鼠。                             离，用 PVDF 膜转移分离的蛋白。将膜用 5% 脱脂奶粉
              取60只难治性癫痫大鼠随机分为模型组、塞来昔布                         封闭 2 h 后，向膜中加入 COX-2（稀释比例 1∶1 500）、
          组（阳性对照）、柴胡加龙骨牡蛎汤组、柴胡加龙骨牡蛎                           P-gp（稀释比例 1∶1 000）和 GAPDH（稀释比例 1∶4 000）
          汤+空载组、柴胡加龙骨牡蛎汤+COX-2 过表达组，每组                        抗体，4 ℃下孵育过夜；再加入辣根过氧化物酶标记的山
          12 只。塞来昔布组和柴胡加龙骨牡蛎汤组大鼠分别于                           羊抗兔 IgG 二抗（稀释比例 1∶4 000）。蛋白条带使用
          每天同一时间灌胃20 mg/kg塞来昔布（以生理盐水为溶                        ECL显影，并使用Image J软件进行定量分析，以目标蛋
             [9]
          剂） 或12 g/kg柴胡加龙骨牡蛎汤1次；柴胡加龙骨牡蛎                       白与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值表示目标蛋
          汤+空载组和柴胡加龙骨牡蛎汤+COX-2 过表达组大鼠                         白的相对表达量。上述实验重复3次。
          每天灌胃12 g/kg柴胡加龙骨牡蛎汤1次，并分别通过尾                        2.8 大鼠海马组织COX-2、P-gp mRNA表达检测
          静脉注射慢病毒空载体或 COX-2 过表达慢病毒载体                              采用 RT-qPCR 法检测。取“2.5”项下部分海马组
                                    8
          200 μL（病毒滴度均为5.0×10  TU/mL），每周1次；假手                 织，采用TRIzol试剂提取总RNA，并用NanoDrop法测定
          术组和模型组大鼠则给予灌胃+尾静脉注射 0.9% 生理                         其浓度和纯度。之后，使用cDNA合成试剂盒合成第一
          盐水。所有大鼠均连续给药/生理盐水8周。                                链 cDNA，再在 RT-qPCR 仪上进行聚合酶链反应。反应
          2.2 大鼠癫痫发作行为学观察                                     体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物各 0.4
                                                [8]
              末次给药结束后，根据 Racine 分级标准 评估各组                     μL，cDNA 5 μL，无菌超纯水4.2 μL。扩增条件：94 ℃预
          大鼠癫痫发作行为学，具体标准为：0 级，癫痫未发作；1                         变性 2 min；94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1
          级，面部肌肉抽搐；2级，颈部肌肉抽搐；3级，单侧前肢阵                         min，共28个循环。使用2        －ΔΔCt 计算mRNA的相对表达水
          挛、抽搐；4级，双侧前肢阵挛、抽搐、身体直立；5级，全身                        平。COX-2正向引物为5′-CTGTATCCCGCCCTGCTG-
          强直阵挛、双侧后肢和身体直立、倒地。                                  GTG-3′，反 向 引 物 为 5′-ACTTGCGTTGATGGTGGC-
          2.3 大鼠海马组织CA3区病理形态学变化观察                             TGTCTT-3′，产物长度为 211 kb；P-gp 正向引物为 5′-
              Racine分级结束后，将大鼠断头并立即将脑组织取                       AACACCCTGGTTGGTGAGAG-3′，反向引物为5′-CA-
          出置于冰板上，迅速剖出海马体，每组随机选取6只大鼠                           CCATCAAAACCAGCAATG-3′，产 物 长 度 为 185  kb；
          的海马组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片（5 μm），                       GAPDH 正向引物为 5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-
          进行 HE 染色，使用光学显微镜观察海马组织 CA3 区病                       3′，反向引物为 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，
          理学变化并拍照。                                            产物长度为112 kb。
          2.4 大鼠海马组织细胞凋亡检测                                    2.9 统计学处理
              取“2.3”项下制备的海马组织石蜡切片，进行脱蜡、                           采用SPSS 22.0软件进行统计分析。满足正态分布
          水化后，使用TUNEL反应混合液进行孵育和染色处理，                          的计量资料以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，进
          每组随机选择 5 个视野在光学显微镜下统计 TUNEL 阳                       一步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          性细胞（呈绿色）数量和细胞总数，计算细胞凋亡率。细胞                          3 结果
          凋亡率（%）＝TUNEL阳性细胞数/视野总细胞数×100%。                      3.1 各组大鼠癫痫发作行为学比较
          2.5 大鼠海马组织COX-2、PGE2、TNF-α水平检测                          假手术组、模型组、塞来昔布组、柴胡加龙骨牡蛎汤
              采用 ELISA 法检测。每组取“2.3”项下剩余 6 只大                  组、柴胡加龙骨牡蛎汤+空载组、柴胡加龙骨牡蛎汤+
          鼠的海马组织，分成三部分，其中两部分组织冻存，剩余                           COX-2过表达组大鼠癫痫Racine分级分别为0、（4.41±
          一部分称重后，使用组织匀浆器在冰上匀浆，并在 4 ℃                          0.45）、（2.18±0.27）、（2.23±0.30）、（2.20±0.29）、（3.96±
          下以2 500×g离心15 min。收集上清液并储存在－80 ℃                    0.38）级。与假手术组比较，模型组大鼠癫痫Racine分级
          冰箱中，采用BCA法检测总蛋白浓度后，检测大鼠海马                           显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，塞来昔布组、柴胡
          组织COX-2、PGE2、TNF-α水平。                               加龙骨牡蛎汤组大鼠癫痫 Racine 分级均显著降低（P＜
          2.6 大鼠海马组织MDA含量和SOD活性检测                             0.05）；与柴胡加龙骨牡蛎汤组、柴胡加龙骨牡蛎汤+空
              采用比色法检测。从冰箱中取出“2.5”项下大鼠海                        载组比较，柴胡加龙骨牡蛎汤+COX-2 过表达组大鼠癫
          马组织匀浆上清液，按照试剂盒说明书方法检测 MDA                           痫Racine分级显著升高（P＜0.05）。
          含量和SOD活性。                                           3.2 各组大鼠海马组织CA3区病理形态学比较
          2.7 大鼠海马组织COX-2、P-gp蛋白表达检测                              假手术组大鼠海马神经元结构完整，排列整齐；与
              采用Western blot法检测。取“2.5”项下部分海马组织                假手术组比较，模型组可见大鼠海马神经元排列疏松，
          于匀浆管中，加入RIPA裂解液研磨离心（4 ℃、2 500×g、                    细胞间隙增大，部分细胞坏死，出现核固缩，胞质空泡样


          · 694 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 6                               中国药房  2025年第36卷第6期
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