Page 65 - 《中国药房》2025年6期
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骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是儿童和青少年最常见 (货号 QPG-023)购自上海吉玛制药技术有限公司;
的原发性恶性骨肿瘤,其主要发生在长骨干骺端,如股 CCK-8细胞增殖检测试剂盒(货号HB-CCK-8)购自汉恒
骨、胫骨和肱骨,容易侵袭局部组织并进一步发展为全 生物工程(上海)有限公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋
身转移 。OS 的治疗方法包括手术切除和化疗。研究 亡试剂盒(货号70-APCC101)购自杭州联科生物技术股
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显示,非转移性OS患者的5年生存率达70% ,但OS患 份有限公司;BCA蛋白定量检测试剂盒(货号KL1DBE09
者仍面临化疗耐药、局部复发、肺转移等诸多挑战。化 5)购自上海康朗生物科技有限公司;特超敏ECL化学发
疗耐药可分为原发性耐药和获得性耐药,阿霉素(doxo‐ 光检测试剂盒(货号EUL002)购自广州博鹭腾生物科技
rubicin,DOX)为OS的常用化疗药物,约50%的OS患者 有限公司;荧光素酶报告基因测试盒(货号 SLLU-200)
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因 DOX 获得性耐药而影响了治疗效果 。因此,了解 购自北京拜尔迪生物技术有限公司;兔源甘油醛-3-磷酸
OS 细胞 DOX 化疗耐药的分子机制对开发新的治疗方 脱氢酶(GAPDH)、兔源增殖细胞核抗原(proliferating
法并最终改善OS患者的预后至关重要。 cell nuclear antigen,PCNA)、兔源 CCND1、辣根过氧化
目前已发现有多种 RNA[如长链非编码 RNA(long
物 酶 标 记 的 山 羊 抗 兔 IgG(货 号 分 别 为 ab226408、
noncoding RNA,LncRNA)、微 小 RNA(microRNA,
ab201673、ab16663、ab9482)均购自英国 Abcam 公司;
miRNA)等]参与调控 OS 的进展、转移和化学耐药性 。
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PCR引物由苏州艾比拓生物技术有限公司设计、合成。
肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung ade-
1.3 细胞来源
nocarcinoma transcript 1,MALAT1)在哺乳动物中广泛
OS 亲代细胞 MG-63、耐 DOX 的 OS 细胞 MG-63/
表达并具有进化保守性,研究显示,LncRNA MALAT1
DOX(货号分别为 AM7868、AM7872)均购自美国典型
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是 OS 的 潜 在 治 疗 靶 点 。 有 报 道 发 现 ,LncRNA 菌种保藏中心。
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MALAT1可以调控乳腺癌的进展和DOX耐药性 ,但其 2 方法
能否调节OS的耐药性尚不清楚。miR-154-5p可在多种
2.1 MG-63和MG-63/DOX细胞对DOX的敏感性检测
癌症中发挥抑癌基因作用,相关研究显示,miR-154-5p
分别将悬浮在 200 μL 培养基(含细胞 5×10 个)中
3
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在DOX耐药OS细胞中表达下调 。细胞周期素D1(cy‐
的MG-63和MG-63/DOX细胞接种于96孔板,分别加入
clin D1,CCND1)位于人 11q13 染色体上,可参与包括
0、0.01、0.05、0.1、1 μmol/L 的 DOX 处理(采用浓度梯度
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OS 在内的多种癌症细胞周期和肿瘤增殖的调控 。本
筛选确定浓度),作为实验组,选择未经任何处理的正常
研究团队前期利用 Starbase 网站分析发现,LncRNA
细胞作为对照组,没有细胞只有培养基等其他成分的作
MALAT1 与 miR-154-5p、miR-154-5p 与 CCND1 之间存
在潜在的结合位点。基于此,本研究拟探讨 LncRNA 为空白组,在 37 ℃、5%CO2条件下孵育 24 h 后,每孔加
MALAT1靶向miR-154-5p/CCND1轴与OS细胞DOX耐 入体积为10 μL的CCK-8试剂,于37 ℃下孵育2 h,使用
药性的关系及可能的作用机制,以期克服 OS 的化疗耐 酶标仪于 450 nm 波长处检测光密度(optical density,
药性,进而提高其治疗效果。 OD),每组设 3 个复孔,每次 2 个平行,计算细胞存活率
1 材料 和半数抑制浓度(IC50 ),细胞存活率(%)=(实验组
1.1 主要仪器 OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。
本研究所用主要仪器包括 DMi1 型倒置显微镜(德 2.2 MG-63和MG-63/DOX细胞LncRNA MALAT1表
国Leica公司)、MSFLO型流式细胞仪(杭州谱育科技发 达检测
展有限公司)、9003021 型实时荧光定量聚合酶链反应 采用 RT-qPCR 法检测。使用 Trizol 试剂提取 MG-
(RT-qPCR)仪[凯杰企业管理(上海)有限公司]、 Multi‐ 63 和 MG-63/DOX 细胞的总 RNA,合成 cDNA,LncRNA
skan FC 型酶标仪(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)、 MALAT1以GAPDH为内参,配置20 μL的反应体系:定
RCCS-4HD型细胞培养仪(美国Synthecon公司)。 量酶10 μL,cDNA 1 μL,正、反向引物各1 μL,去离子水
1.2 主要药品与试剂 7 μL;反应条件:98 ℃变性10 s,57 ℃退火30 s,68 ℃延
DOX(货号 51410ES10,纯度≥98%)购自翌圣生物 伸 45 s,共 35 个循环。根据 2 -ΔΔCt 计算 MG-63 和 MG-63/
科技(上海)股份有限公司;敲低 LncRNA MALAT1(sh- DOX 细胞中 LncRNA MALAT1 的相对表达量。引物序
MALAT1)及 其 阴 性 对 照(sh-NC)、抑 制 miR-154-5p 列及产物长度见表1。
(anti-miR-154-5p)及其阴性对照(anti-NC)质粒均购自 表1 qRT-PCR引物序列及产物长度
上海吉凯基因医学科技股份有限公司;DMEM 培养基 基因 正向引物序列(5'→3') 反向引物序列(5'→3') 产物长度/bp
(货号iCell-0003)购自镜像绮点(上海)细胞技术有限公 LncRNA MALAT1 GACGGAGGTTGAGATGAAGC ATTCGGGGCTCTGTAGTCCT 84
miR-154-5p GCCTTCGCTCAACTGAATTG CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC 93
司;总RNA提取试剂盒(TRIzol法)、含脱氧核糖核酸酶
CCND1 GGATGCTGGAGGTCTGCGA AGAGGCCACGAACATGCAAG 146
Ⅰ逆转录试剂盒(货号分别为 EZB-TZ1-L、RT3C)均购 U6 CTCGCTTCGGCAGCACA AACGCTTCACGAATTTGCG 96
自上海海方生物技术有限公司;RT-qPCR 检测试剂盒 GAPDH GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA AATGAAGGGGTCATTGATGG 109
中国药房 2025年第36卷第6期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 6 · 699 ·