Page 58 - 《中国药房》2025年3期
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CCA 的剪口处插入 ICA，缓慢向前推进约 20 mm，使尼                     5 000）室温孵育1 h；在暗室中加入增强型化学发光液显
          龙线末端位于大脑前动脉进而堵塞大脑中动脉；缺血2 h                          色成像，采用 Image J 图像分析系统对蛋白条带灰度值
          后，缓慢匀速拔出尼龙线栓实现再灌注。假手术组大鼠                            进行分析，以目的蛋白与内参蛋白 GAPDH 的灰度值比
          进行相同的手术操作，但不插入线栓。再灌注 24 h 后，                        值表示目的蛋白的表达水平。

          采用 Zea-Longa 评分法对大鼠进行神经功能评分：无明                      2.7 大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、GPX4 mRNA表达水平
          显的神经功能缺损症状为0分；提尾时向左侧前肢屈曲                            检测
          为1分；不能直行，向左侧行走为2分；行走困难，站立或                              取“2.2”项下各组3只大鼠缺血侧脑组织（假手术组
          爬行时向左侧倾倒为3分；无法自主行走伴意识障碍为                            对应侧脑组织）10 mg，采用 Trizol 法提取总 RNA，测定
          4 分。1～3 分为造模成功；0 分为造模失败；评分为 4 分                     浓度和纯度后，参照试剂盒说明书逆转录为cDNA进行
          的大鼠容易死亡，予以剔除 。造模过程中，模型组大                            PCR扩增。PCR体系（20 μL）为：PCR试剂10 μL，正、反
                                  [12]
          鼠死亡 3 只，银杏叶提取物组死亡 1 只，心脑舒通低、高                       向引物各 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ROX 试剂 0.4 μL，
          剂量组均死亡2只。评分完成后，麻醉大鼠，腹主动脉采                           ddH2O 7.6 μL。PCR 扩增条件为：95 ℃预变性 2 min；
          血，血样静置1 h后以3 000 r/min离心10 min，吸取上清                 95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 s，共 40 个
          液，于－80 ℃冰箱中保存，备用。采血后，大鼠迅速断头                         循环。以 GAPDH 为内参，采用 2         －ΔΔCt 法进行数据分析，
          取出脑组织，生理盐水清洗 2 遍，滤纸拭干后于－80 ℃                        计算 Nrf2、HO-1、GPX4 mRNA 表达水平。引物序列及
          冰箱中保存备用。                                            产物大小见表1。
                                                                          表1 引物序列及产物大小
          2.3 大鼠脑梗死面积检测
                                                              基因           序列（5′→3′）                 产物大小/bp
              取“2.2”项下各组 4 只大鼠的脑组织，去除脑干、小
                                                              GAPDH        正向：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG   138
          脑和嗅球后于－20 ℃冷冻20 min；用手术刀片将脑组织                                    反向：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
          沿冠状面均匀切成 5 片（每片厚 2 mm），然后用 2%TTC                    HO-1         正向：CAGCATGTCCCAGGATTTGTC    104
                                                                           反向：CCTGACCCTTCTGAAAGTTCCTC
          染液于37 ℃水浴条件避光染色15 min，再以4%多聚甲                       Nrf2         正向：GACATCCTTTGGAGGCAAGACAT  268
          醛固定后拍照，正常部位为红色，梗死区为白色。将                                          反向：TGGGAATGTGGGCAACCTG
                                                              GPX4         正向：ATTCCCGAGCCTTTCAACCC     263
          TTC 染色图片导入 Image J 软件计算梗死面积，并计算                                  反向：TATCGGGCATGCAGATCGAC
          脑梗死率，脑梗死率＝梗死面积/横切总面积×100%。                          2.8 统计学分析
          2.4 大鼠脑组织病理学变化观察                                        采用 SPSS 软件和 GraphPad Prism 软件分别进行数
              取“2.2”项下各组 3 只大鼠的脑组织适量，以 4% 多                   据分析及作图。计量资料x±s表示，多组间比较采用单
          聚甲醛固定24 h后进行石蜡包埋切片，将切片脱蜡后进                          因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验水
          行苏木素-伊红（HE）染色，然后采用光学显微镜观察大                          准α＝0.05。
          鼠脑组织病理学变化。                                          3 结果
          2.5 大鼠脑组织中总铁水平和血清中 LPO、MDA、                         3.1 心脑舒通胶囊对大鼠脑梗死面积的影响
          GSH水平检测                                                 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织出现明显的脑
              取“2.2”项下各组大鼠血清适量以及各组 3 只大鼠                      梗死现象，脑梗死率为（29.10±5.94）%。与模型组比
          脑组织适量，根据 ELISA 试剂盒方法处理，检测大鼠脑                        较，银杏叶提取物组和心脑舒通低、高剂量组大鼠脑梗
          组织中总铁水平和血清中LPO、MDA和GSH水平。                           死率[分别为（20.18±3.54）%、（20.04±3.2）%、（22.01±
          2.6 大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达水平检测                    5.22）%]均显著降低（P＜0.05）。结果见图1。
              取“2.2”项下各组3只大鼠缺血侧脑组织（假手术组                       3.2 心脑舒通胶囊对大鼠脑组织病理损伤的影响

          对应侧脑组织）适量，加入 RIPA 裂解液裂解，冷冻研磨                            由图2可见，假手术组大鼠神经细胞核膜清晰完整，
          仪中研磨后，以 12 000 r/min 离心 10 min，吸取上清液，               排列正常有序。与假手术组比较，模型组大鼠缺血核心
          采用 BCA 法测定蛋白浓度。蛋白变性处理后，以十二                          区脑组织神经细胞呈空泡样改变，出现大片坏死细胞，
          烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再转移至                            神经细胞数目减少且排列紊乱，间质水肿，细胞核固缩。
          PVDF 膜，以封闭液封闭 1 h，加入 Nrf2、HO-1、GPX4、                银杏叶提取物组和心脑舒通低、高剂量组大鼠的脑组织
          GAPDH一抗（稀释度分别为1∶2 000、1∶2 000、1∶3 000、              病理损伤均有不同程度减轻，神经细胞数目增多，水肿
          1∶1 000）于 4 ℃下孵育过夜，再加入二抗（稀释度为 1∶                    减轻，核膜平整。


          · 308 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 3                               中国药房  2025年第36卷第3期
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