Page 65 - 《中国药房》2025年2期
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质粒、FBP1 小干扰 RNA 及其阴性对照小干扰 RNA（批 浓度四物汤含药血清处理 72 h ），并设置不含细胞、不
号分别为 91822、91889、91890）均购自上海吉玛制药技 含药物的调零组，每组设置 6 个复孔。每孔加入 CCK-8
术有限公司；TurboFect 转染试剂和 RNA 反转录试剂盒 溶液10 μL，反应2 h，使用酶标仪于450 nm波长下检测
（批号分别为 R0531、K1691）均购自美国 Thermo Fisher 各孔的吸光度（A）值并按下式计算细胞存活率：细胞存
Scientific公司。 活率（%）＝（实验组 A 值－调零组 A 值）/（对照组 A 值－
1.3 动物 调零组A值）×100%。根据检测结果筛选后续实验含药
3 月龄 SPF 级雌性 SD 大鼠 40 只，体重（290±50）g， 血清的干预浓度。
用于含药血清的制备。大鼠由河南省实验动物中心提 2.4 细胞中自噬体数量检测
供，动物生产许可证号为SCXK（豫）2020-0001。所有动 取 KGN 细胞，按 2×10 个/孔接种于 24 孔板中，于
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物均饲养于温度（23±1）˚C、相对湿度（50±5）%、每12 h 37 ˚C、5%CO2条件下孵育 24 h，待细胞融合至 70% 时进
明暗循环的环境下，自由摄食、饮水。本动物实验方案 行 GFP-LC3 质粒转染（将 GFP-LC3 质粒 0.5 μg 与无血
经河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院实验 清 DMEM/F12 培养基 100 μL 混合，随后加入 TurboFect
动 物福利伦理委员会批准（批准文号 PZ-HNSZYY- 转染试剂2 μL混匀，转染48 h），若荧光显微镜下可见细
2022-070）。 胞发出明显的绿色荧光即为转染成功。取转染后的细
1.4 细胞 胞，分为对照组、DHEA 组、空白血清组、中浓度四物汤
人卵巢颗粒细胞 KGN（批号 CL-0603）购自武汉普 含药血清组（四物汤含药血清干预浓度根据“2.3”项下结
诺赛生命科技有限公司。 果设置），各组细胞均按“2.3”项下方法处理，每组设置6
2 方法 个复孔。取各组细胞，用 4% 多聚甲醛溶液于室温下固
2.1 四物汤颗粒药液制备 定20 min，再加入0.02%Triton X-100试剂于室温下孵育
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按相关文献 的组方配比制备四物汤颗粒药液：取 5 min，用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后，使用
熟地黄、当归、白芍、川芎配方颗粒，按饮片质量 15∶10∶ 荧光显微镜观察细胞中的自噬体（GFP-LC3绿色荧光斑
10∶6 混合，溶于生理盐水中，制成相应浓度的四物汤颗 点）并记录其数量。
粒药液，备用。 2.5 细胞中自噬相关蛋白、mTOR 蛋白、FBP1 蛋白及
2.2 空白血清和含药血清制备 mRNA表达检测
所有雌性SD大鼠适应性喂养3 d后，随机分为空白 采用 Western blot 法检测相关蛋白表达。取对数生
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血清组和低、中、高剂量四物汤含药血清组，每组10只。 长期的 KGN 细胞，按 5×10 个/孔接种于 6 孔板中，按
四物汤颗粒成人用量为 5 g/d，按成人体重 60 kg 换算得 “2.4”项下方法分组、处理。收集各组细胞，加入RIPA裂
日剂量，为 0.083 3 g/（kg·d）；再进一步换算得大鼠给药 解液提取总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度后加热变性。
低剂量，为 0.52 g/（kg·d） 。空白血清组大鼠灌胃等体 取变性蛋白30 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移
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积生理盐水，低、中、高剂量四物汤含药血清组大鼠分别 到硝酸纤维素膜上，用 5% 脱脂奶粉于室温下孵育 2 h；
灌胃四物汤颗粒 0.52、1.04、2.08 g/（kg·d），每天灌胃 2 洗膜后，加入自噬相关蛋白一抗（LC3、p62，稀释比例分
次，持续3 d。末次灌胃后3 h，各组大鼠经腹腔麻醉并于 别为 1∶900、1∶800）、通路相关蛋白一抗（FBP1、mTOR、
腹主动脉取血；血样于 4 ˚C 下静置 1 h，再以 3 000 r/min p-mTOR，稀释比例分别为1∶700、1∶700、1∶1 000）、内参
离心 10 min，收集上层血清，过滤；血清于 56 ˚C 下灭活 蛋白一抗（GAPDH，稀释比例为1∶1 000），于4 ℃下孵育
30 min，即得空白血清和低、中、高浓度四物汤含药血清， 过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为 1∶2 000），于
于－20 ˚C保存，备用。 37 ℃下孵育 1 h；洗膜后，加入发光试剂，并置于化学发
2.3 药物干预浓度筛选 光凝胶成像分析系统下显影曝光。使用Image Lab软件
取 KGN 细胞，接种于含 10% 胎牛血清的 DMEM/ 分析各蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白的条带
F12 培养基中，于 37 ˚C、5%CO2条件下培养。待细胞生 灰度值比值表示目的蛋白的表达水平，再以 LC3-Ⅱ与
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长至对数期后，以2×10 个/孔接种于96孔板中，并分为 LC3-Ⅰ的表达水平比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）表示自噬活
对照组（不进行任何处理）、DHEA 组（以 50 μmol/L 的 性 ，以 p-mTOR 与 mTOR 的 表 达 水 平 比 值（p-mTOR/
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DHEA 处理 48 h，以构建 PCOS 细胞模型 ）、空白血清 mTOR）表示 mTOR 蛋白的磷酸化水平。结果以对照组
组（以50 μmol/L的DHEA处理48 h后，再用10%空白血 为参照进行归一化处理。
清处理 72 h）和低、中、高浓度四物汤含药血清组（以 50 采用实时荧光定量 PCR 法检测 FBP1 mRNA 表达。
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μmol/L 的 DHEA 处理 48 h 后，分别再用 10% 低、中、高 取对数生长期的 KGN 细胞，按 5×10 个/孔接种于 6 孔
中国药房 2025年第36卷第2期 China Pharmacy 2025 Vol. 36 No. 2 · 187 ·
