Page 66 - 《中国药房》2025年2期

板中，按“2.4”项下方法分组、处理。收集细胞，经Trizol 药血清组细胞的存活率[（52.5±6.7）%、（78.3±7.8）%、
试剂裂解后，提取总 RNA，经纯度、含量检测后，将其反 （81.6±6.9）%]均显著升高（P＜0.05）。其中，中浓度四
转录合成 cDNA，再以此 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。 物汤含药血清组细胞的存活率与高浓度四物汤含药血
PCR 反应体系包括 cDNA 模板 1 μL，PCR 正/反向引物 清组比较差异无统计学意义（P＞0.05），遂后续仅使用
各0.5 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，双蒸水 8 中浓度四物汤含药血清进行实验。
μL，共 20 μL。PCR 反应条件为 95 ℃预变性 3 min； 3.2 四物汤含药血清对KGN细胞自噬及相关蛋白表达
95 ℃变性 5 s，60 ℃退火延伸 30 s，共循环 40 次。以 的影响
GAPDH 为内参，用 2 －ΔΔCt 法计算 FBP1 mRNA 的表达水 与对照组比较，DHEA组细胞中自噬体数量明显增
平。PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司设计、合 多，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著升高，p62 蛋白的表达水平显著
成 。 FBP1 正 向 引 物 序 列 为 5′-CTCTATGGCATTGC- 降低（P＜0.05）。与 DHEA 组和空白血清组比较，中浓
TGGTTCTA-3′，反向引物序列为 5′-CGTGGCAAAGG- 度四物汤含药血清组细胞中自噬体数量明显减少，LC3-
ATGACTTTAAC-3′，扩增产物长度为 108 bp；GAPDH Ⅱ/LC3-Ⅰ显著降低，p62蛋白的表达水平显著升高（P＜
正向引物序列为5′-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3′， 0.05）。结果见图1、图2、表1。
反向引物序列为5′-ATTGGGCTCTTCCACACAGG-3′，
扩增产物长度为 166 bp。结果以对照组为参照进行归
一化处理。
2.6 敲低FBP1对四物汤含药血清作用的影响检测
取 KGN 细胞，按 2×10 个/孔接种于 24 孔板中，于
5
37 ˚C、5%CO2条件下培养 24 h，待细胞融合至 80% 时进 20 μm 20 μm
行细胞转染[取阴性对照小干扰 RNA 和 FBP1 小干扰 A.对照组 B. DHEA组
RNA各1 μg，分别与不含血清的DMEM/F12培养基（含
TurboFect 转染试剂 2.5 μL）1 mL 混合，再与 KGN 细胞
共同孵育 24 h，即得阴性对照小干扰 RNA 转染细胞和
FBP1 小干扰 RNA 转染细胞，Western blot 检测示二者
FBP1蛋白表达水平分别较未转染细胞变化不大或显著
20 μm 20 μm
降低，即为转染成功]。将 KGN 细胞和转染细胞分为四
C.空白血清组 D.中浓度四物汤含药血清组
物汤组（以 50 μmol/L 的 DHEA 处理 KGN 细胞 48 h 后， 图1 各组细胞中自噬体数量的显微图
再用 10% 中浓度四物汤含药血清处理 72 h）、四物汤+
16 kDa
LC3-Ⅰ
si-NC 组（以 50 μmol/L 的 DHEA 处理阴性对照小干扰 LC3-Ⅱ 14 kDa
RNA 转染细胞 48 h 后，再用 10% 中浓度四物汤含药血 p62 62 kDa
清 处 理 72 h）、四 物 汤 +si-FBP1 组（以 50 μmol/L 的 GAPDH 36 kDa
DHEA 处理 FBP1 小干扰 RNA 转染细胞 48 h 后，再用 对照组 DHEA组 空白血清组 中浓度四物汤
含药血清组
10%中浓度四物汤含药血清处理72 h），每组设置6个复
图2 各组细胞中自噬相关蛋白表达的电泳图
孔。取各组细胞，按“2.3”项下方法检测其存活率，按
表1 各组细胞中自噬相关蛋白表达比较（x±s，n＝6）
“2.5”项下方法检测 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-mTOR/mTOR 和
组别 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ p62
p62蛋白、FBP1蛋白及mRNA的表达水平。 对照组 1.00±0.07 1.00±0.03
2.7 统计学方法 DHEA组 2.41±0.16 a 0.39±0.07 a
空白血清组 2.32±0.17 0.41±0.05
采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。实验数
中浓度四物汤含药血清组 1.43±0.06 bc 0.78±0.05 bc
据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与DHEA组比较，P＜0.05；c：与空白
步两两比较采用Bonferroni检测。检验水准α＝0.05。 血清组比较，P＜0.05。
3 结果 3.3 四物汤含药血清对 KGN 细胞中通路相关蛋白、
3.1 四物汤含药血清干预浓度的筛选结果 mRNA表达的影响
与对照组（100%）比较，DHEA 组细胞的存活率 与对照组比较，DHEA 组细胞中 p-mTOR/mTOR、
[ （35.4±3.6）%]显著降低（P＜0.05）。与 DHEA 组和空 FBP1 蛋白及 mRNA 的表达水平均显著升高（P＜0.05）。
白血清组[（34.8±4.5）%]比较，低、中、高浓度四物汤含 与DHEA组和空白血清组比较，中浓度四物汤含药血清

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