Page 42 - 《中国药房》2024年24期
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组、隐丹参酮高剂量+AMD3100 组，每组 10 只。取剩余                     表达量，结果以对照组为参照进行归一化处理。SDF-1
          大鼠10只，以生理盐水代替VCD注射，作为对照组。                           的 正 向 引 物 为 5′-GAGCCAACGTCAAACATCTGAA-
              隐丹参酮低、高剂量组大鼠分别灌胃50、100 mg/kg                    3′，反 向 引 物 为 5′-TCCAGGTACTCTTGGATCCACT-
          的隐丹参酮（以二甲基亚砜为溶剂，剂量参考相关文                             TTA-3′，产 物 大 小 为 142  bp；CXCR4 的 正 向 引 物 为
            [6]
          献 ）并腹腔注射与 AMD3100 等体积的生理盐水；隐丹                       5′-AGTGACCCTCTGAGGCGTTTG-3′，反 向 引 物 为
          参酮高剂量+AMD3100组大鼠灌胃100 mg/kg的隐丹参                     5′-GAAGCAGGGTTCCTTGTTGGAGT-3′，产物大小为
          酮并腹腔注射2.5 mg/kg的AMD3100（以水为溶剂，剂量                    115 bp；β-actin 的正向引物为 5′-CCTCTATGCCAACA-
                      [9]
          参考相关文献 ），对照组和模型组大鼠以相同方式灌胃                           CAGTGC-3′，反 向 引 物 为 5′-GTCCTCCTGCTTGCT-
          并腹腔注射等体积生理盐水，每天1次，连续4周。                             GATCC-3′，产物大小为126 bp。
          2.2 样本采集                                            2.8 卵巢组织中 caspase-3、Bax、Bcl-2、SDF-1、CXCR4
              末次给药后，抽取各组大鼠主动脉血3 mL，备测；然                       蛋白表达检测
          后，将大鼠麻醉，断头处死，取其卵巢组织，备测。                                 采用Western blot法检测。取“2.7”项下各组大鼠卵
          2.3 血清中E2、FSH、LH水平检测                                巢组织匀浆适量，以裂解液裂解后提取总蛋白，经定量
              取“2.2”项下各组大鼠血液样品，静置后以 3 500                     后将其煮沸变性。取变性蛋白适量，进行十二烷基硫酸

          r/min 离心 10 min，收集上层血清，根据相应试剂盒说明                    钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜
          书方法操作，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法以酶标                         上，以脱脂奶粉室温封闭 2 h；洗膜后，加入 caspase-3、
          仪检测其血清中E2、FSH、LH水平。                                 Bax、Bcl-2、SDF-1、CXCR4、β-actin 一抗（稀释比例均为
          2.4 卵巢组织中ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平检测                     1∶1 500），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀
              取“2.2”项下各组大鼠卵巢组织适量，低温匀浆后，                       释比例为 1∶5 000），于 37 ℃下孵育 2 h；洗膜后，以 ECL
          以 4 000 r/min 离心 10 min，取上清液，按照相应试剂盒                试剂显影。成像后，使用 Image J 软件分析蛋白的相对
          说明书方法操作，分别采用化学荧光法、硫代巴比妥酸                            表达量（即各目的蛋白与内参蛋白β-actin的条带灰度值
          法、羟胺法、比色法以紫外分光光度计检测其卵巢组织                            比值）。
          中ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平。                              2.9 统计学方法
          2.5 卵巢组织形态观察                                            采用 GraphPad Prism 8.0.1 软件对数据进行统计分
              取“2.2”项下各组大鼠卵巢组织适量，以4%多聚甲                       析。数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
          醛溶液固定24 h；取部分，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后                         析 ，进 一 步 两 两 比 较 采 用 SNK-q 检 验 。 检 验 水 准
          切片，进行HE染色后，使用显微镜观察其卵巢组织的形                           α＝0.05。
          态学变化。                                               3 结果
          2.6 卵巢组织细胞凋亡检测                                      3.1 隐丹参酮对大鼠血清中E2、FSH、LH水平的影响
              采用TUNEL法检测。取“2.5”项下各组大鼠经固定                          与对照组比较，模型组大鼠血清中 E2水平显著降
          的卵巢组织适量，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后切片，按                           低，FSH、LH水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，
          照试剂盒说明书方法进行 TUNEL 染色，使用显微镜观                         隐丹参酮低、高剂量组大鼠血清中 E2水平均显著升高，
          察其卵巢组织细胞凋亡情况并计算细胞凋亡率：细胞凋                            FSH、LH 水平均显著降低（P＜0.05）。与隐丹参酮高剂
          亡率＝TUNEL 阳性细胞（呈紫红色）数/总细胞数×                          量组比较，隐丹参酮高剂量+AMD3100组大鼠血清中E2
          100%。                                               水平显著降低，FSH、LH水平均显著升高（P＜0.05）。结
          2.7 卵巢组织中SDF-1、CXCR4 mRNA表达检测                       果见表1。
              采用 qRT-PCR 法检测。取“2.2”项下各组大鼠卵巢                   表1 各组大鼠血清中E2、FSH、LH水平比较（x±s，n＝
          组织适量，低温匀浆。取部分，以 Trizol 试剂提取总                             10）
          RNA，经纯度、含量检测后，将 RNA 逆转录为 cDNA，再                     组别               E 2/（nmol/L）  FSH/（IU/L）  LH/（IU/L）
                                                              对照组              24.72±2.59  17.28±1.62  6.23±0.57
          进行 PCR 扩增。反应体系包括 cDNA 模板 1.6 μL，2×
                                                              模型组              10.34±1.24 a  32.47±2.93 a  15.87±1.36 a
          Ultra  SYBR  Mixture  10  μL，正 、反 向 引 物 各 0.8  μL，  隐丹参酮低剂量组         14.87±1.68 b  27.52±2.48 b  12.41±1.15 b
          ddH2O 6.8 μL。反应条件如下：95 ℃预变性 30 s；95 ℃               隐丹参酮高剂量组         19.56±2.17 b  22.64±2.17 b  8.74±0.82 b
                                                              隐丹参酮高剂量+AMD3100组  13.61±1.46 c  28.39±2.75 c  13.67±1.24 c
          变性 15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 个循环。以 β-actin
                                                                 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与隐丹参
          为内参，采用2     －ΔΔCt 法计算SDF-1、CXCR4 mRNA的相对            酮高剂量组比较，P＜0.05。


          · 3000 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 24                            中国药房  2024年第35卷第24期
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