Page 56 - 《中国药房》2024年22期
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（phosphorylated  TBK1，p-TBK1）、IRF3、磷 酸 化 IRF3        次给药结束后24 h各测量1次，体重减轻百分比＝（造模
         （phosphorylated IRF3，p-IRF3）单克隆抗体（批号分别为              结束后体重－末次给药结束后24 h体重）/造模结束后体
          abs148670、abs148596、abs124576、abs140593）均购自爱        重×100％]、粪便性状及出血状况来确定 DAI，DAI＝
          必信（上海）生物科技有限公司；兔源 STING、NF-κB                      （体重减轻评分+粪便性状评分+大便隐血或出血评分）/
          p65、磷酸化 NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-       3，具体评分标准 见表 1。评分结束后，各组大鼠以颈
                                                                            [12]
          NF-κB p65）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗                   椎脱臼法处死，取其病变处结肠组织（对照组大鼠取相
          体（批号分别为 ab288157、ab19870、ab76302、ab9485）均           同部位结肠组织，下同），使用结肠黏膜损伤指数（co‐
          购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔                          lonic mucosal damage index，CMDI）评估其结肠黏膜损
          免疫球蛋白 G 二抗（批号 DKY0991A）购自西宝生物科                      伤程度，具体评分标准如下：结肠组织正常，记0分；结肠
          技（上海）有限公司。                                          组织没有溃疡但可见水肿，记1分；结肠组织糜烂并伴有
          1.3 实验动物                                            水肿，记 2 分；结肠组织存在直径≤10 mm 的单个溃疡，
              SPF级雄性Wistar大鼠（体重324～356 g）购自常州                 记 3 分；结肠组织存在直径≤10 mm 的多个溃疡或直
          卡文斯实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK（苏）                          径＞10 mm 的单个溃疡，记 4 分；结肠组织存在直径＞
          2021-0013。所有大鼠均置于无特定病原体的环境（温                        10 mm的多个溃疡，记5分 。
                                                                                    [13]
          度 21～25 ℃、相对湿度 50％～70％、黑暗/光照周期 12                                  表1 DAI评分标准
          h），自由摄食、饮水，并适应性饲养1周。本实验在河北                          评分/分     体重减轻/％         粪便性状         大便隐血或出血
          北方学院动物实验室进行，实验方案经该院伦理委员会                            0          ＜1            正常            正常
                                                              1          1～5            －             －
          批准，批准编号为伦理基础-2023-031。
                                                              2          6～10          松散           隐血阳性
          2 方法                                                3          11～15          －             －
                                                              4          ＞15           腹泻           显性出血
          2.1 造模、分组与给药
                                                                 －：粪便性状、大便隐血或出血项评分只有0、2、4分3个等级。
                           [9]
              依据相关文献 方法建立 UC 大鼠模型：取 69 只大
                                                              2.3 大鼠结肠组织病理学变化观察
          鼠，禁食、不禁水24 h后以乙醚麻醉，将导尿管沿肛门插
                                                                  随机选取每组 8 只大鼠的结肠组织适量，在室温下
          入约 8 cm，然后在肠腔内缓慢注入 5％三硝基苯磺酸溶
                                                              固定于4％多聚甲醛溶液中24 h，经梯度乙醇脱水、二甲
          液 2 mL/kg 和 50％乙醇 0.3 mL，接着注入空气 0.5 mL，
                                                              苯清洗、石蜡包埋后切片（厚约5 μm）；切片经二甲苯脱
          轻揉大鼠腹部 5 min。若大鼠出现血便、稀便和肛周污
                                                              蜡、梯度乙醇脱水后，依次用苏木精染色液染色 5 min、
          秽，且其结肠组织（随机选取5只）出现明显病变及炎症
                                                              伊红染色液染色 2～3 min，经中性树脂封片后，置于光
                                          [9]
          细胞浸润，则表明 UC 模型复制成功 。将造模成功的
                                                              学显微镜下观察结肠组织病理学形态。随机选取每只
          64只UC大鼠随机分成模型组，ASP低、高剂量组（17.5、
                                                              大鼠的5个切片，根据结肠黏膜下层炎症细胞浸润、隐窝
          35 mg/kg 的 ASP ），ASP 高剂量+STING 激活剂组（35
                        [10]
                                           [11]
          mg/kg 的 ASP+20 mg/kg 的 ADU-S100 ），每组 16 只。          缺失等特征进行组织病理学评分，总分为4分，得分越高
                                                              表示结肠组织病理损伤越严重。具体标准为：结肠黏膜
          另取16只正常大鼠，于肠腔内注入等体积生理盐水，并
          注入空气 0.5 mL，轻揉腹部 5 min，作为对照组。ASP                    正常，记0分；结肠隐窝部分缺失，记1分；结肠隐窝完全
          低、高剂量组大鼠分别灌胃 17.5、35 mg/kg 的 ASP（以生                 缺失，黏膜下层有轻度炎症细胞浸润，但固有层上皮表
          理盐水为溶剂，按10 mL/kg灌胃），同时腹腔注射生理盐                       面仍保持完整，记2分；结肠隐窝完全缺失，黏膜下层有
          水（10 mL/kg）；ASP 高剂量+STING 激活剂组大鼠灌胃                  严重的炎症细胞浸润，但固有层上皮表面仍保持完整，
          35 mg/kg 的 ASP（以生理盐水为溶解，按 10 mL/kg 灌                记 3 分 ；结 肠 糜 烂 并 伴 有 明 显 的 炎 症 细 胞 浸 润 ，
                                                                   [14]
          胃），同时腹腔注射 20 mg/kg 的 ADU-S100（以生理盐水                 记4分 。
          为溶剂，按10 mL/kg注射）；对照组和模型组大鼠分别灌                       2.4 大鼠结肠组织细胞凋亡情况检测
          胃和腹腔注射生理盐水 10 mL/kg。各组大鼠均每天予                            采用TUNEL法检测。取“2.3”项下各组大鼠的结肠
          相应药液/生理盐水1次，连续14 d。                                 组织石蜡切片，于室温下以二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱
          2.2 大鼠UC严重程度评估及结肠黏膜损伤指数评分                           水（每次 3 min）后，放入蛋白酶 K 溶液中于室温下孵育
              末次给药结束后 24 h，使用疾病活动指数（disease                   20 min；然后根据 TUNEL 检测试剂盒说明书方法对切
          activity index，DAI）评估各组大鼠UC的严重程度：通过                 片进行标记，以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染
          测量各组大鼠的体重减轻情况[体重于造模结束后和末                            核5 min，随后用抗荧光淬灭剂终止反应；经中性树脂封


          · 2758 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 22                            中国药房  2024年第35卷第22期
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