Page 21 - 《中国药房》2024年22期

2.2.3 包封率和载药量测定 3.0 PTX-PLGA-NPs
2.5 PTX对照品
采用 HPLC 法测定。精密称取 PTX 对照品 3.20 2.0 PLGA
mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，得 吸光度 1.5
1.0
质量浓度为 320 μg/mL 的 PTX 储备液。精密量取该 0.5
0
PTX 储备液适量，依次用甲醇稀释，制得质量浓度分别 200 300 400 500 600 700
波长/nm
为 160、80、40、20、10、5 μg/mL 的系列对照品溶液。上
图3 PLGA、PTX对照品和PTX-PLGA-NPs紫外-可见
述溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，进样分析，记录峰面
光光谱图
积。色谱柱为ZorbaxSB-C18 （250 mm×4.60 mm，5 μm），
2.2.5 稳定性考察
流动相为甲醇-水（75∶25，V/V），流速为 1 mL/min，检测
取“2.1”项下所制PTX-PLGA-NPs适量，于4 ℃下避
波长为 227 nm，柱温为 30 ℃，进样量为 10 μL。以 PTX
光放置7 d，并分别于放置1、2、4、7 d时测定粒径和PDI，
峰面积（Y）对其质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程
以考察其稳定性。每样品平行测定3次。结果（表1）显
2
为 Y＝21 071X+5 406（R ＝0.999 9），结果表明，PTX 在
示，在上述条件下，PTX-PLGA-NPs的粒径无明显变化，
5～160 μg/mL 的质量浓度范围内与峰面积呈良好的线
且平均PDI均小于0.3，表明制剂稳定性良好。
性关系；精密度、准确度、回收率等方法学考察结果均符
表1 PTX-PLGA-NPs稳定性考察结果（x±s，n＝3）
合2020年版《中国药典》（四部）的相关要求。
放置时间/d 粒径/nm PDI
取“2.1”项下所制 PTX-PLGA-NPs 1 mL，以 13 000 1 174.55±7.52 0.08±0.01
r/min 离心 15 min，取上清液 500 μL，置于 5 mL 容量瓶 2 182.97±1.07 0.23±0.01
4 189.33±1.99 0.14±0.05
中，以甲醇定容，超声3 min后过0.22 μm微孔滤膜，取滤
7 197.43±0.65 0.17±0.02
液按上述色谱条件进样测定，记录峰面积并代入回归方
2.3 PTX-PLGA-NPs的体外抗肿瘤活性考察
程，计算得未包封 PTX 的量。取“2.1”项下所制 PTX-
2.3.1 细胞存活率考察
PLGA-NPs 500 μL置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，超
采用CCK-8法检测。取对数生长期的LLC细胞，按
声3 min破乳后过0.22 μm微孔滤膜，取滤液按上述色谱 每孔 1×10 个接种于 96 孔板中，于 37 ℃、5%CO2条件
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条件进样测定，记录峰面积，代入回归方程计算得制剂 （下同）下孵育过夜，待细胞贴壁后，弃去培养基，将细胞
中包封和未包封PTX的总量。取“2.1”项下已知质量且 分为对照组、PTX 组和 PTX-PLGA-NPs 组，并设置不含
已干燥的 PTX-PLGA-NPs，加适量甲醇溶解，超声 3 min 细胞、不含药物的空白组，每组设置5个复孔。对照组细
破乳后过 0.22 μm 微孔滤膜，取滤液按上述色谱条件进 胞加入新鲜培养基，药物组细胞分别加入含 PTX 对照
样测定，记录峰面积并代入回归方程，计算得纳米粒制 品、PTX-PLGA-NPs（PTX 质量浓度均为 0.7、1.4、2.8、
剂中所含 PTX 的量。取“2.1”项下所制 PTX-PLGA-NPs 5.6、11.2 μg/mL，参考前期预实验结果设置）的新鲜培养
适量，以 13 000 r/min 离心 15 min，沉淀用水洗涤 3 次后 基。孵育24 h后，弃去培养基，每孔细胞用PBS清洗2次
再次离心，收集沉淀，干燥后称重，得纳米粒制剂总质 后，加入 CCK-8 试剂 100 μL，孵育 2 h，使用酶标仪于
量。按下式计算包封率（entrapped efficiency，EE）和载 450 nm波长处检测各孔吸光度值，并按下式计算细胞存
药量（drug loading，DL）：EE＝（微粒制剂中包封和未包 活率：细胞存活率＝（实验组吸光度值－空白组吸光度
值）/（对照组吸光度值－空白组吸光度值）×100%。结
封 PTX 的总量－液体介质中未包封 PTX 的量）/微粒制
果数据以 x±s 表示，采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析
剂中包封和未包封 PTX 的总量×100%，DL＝制剂中所
（多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用
含PTX的量/制剂总质量×100%。每样品平行测定3次。
LSD-t检验），检验水准α＝0.05（统计方法下同）。
结果显示，PTX-PLGA-NPs的EE为（52.32±0.66）%，DL
结果（图4）显示，随着药物浓度的增加，PTX-PLGA-
为（7.07±0.18）%。
NPs和PTX对LLC细胞的毒性均随之增强；当PTX质量
2.2.4 紫外-可见光吸收特征检测
浓度为11.2 μg/mL时，PTX-PLGA-NPs组细胞的存活率
取PLGA、PTX对照品和“2.1”项下所制PTX-PLGA-
显著低于同质量浓度PTX组（P＜0.05）。
NPs各适量，用甲醇稀释后置于石英皿中，以甲醇作为空 2.3.2 细胞存活情况检测
白对照，对其进行紫外-可见光吸收光谱（波长190～700 采用 Calcein-AM/PI 双染法检测。取对数生长期的
nm）扫描。结果（图 3）显示，PTX-PLGA-NPs、PTX 对照 LLC 细胞，按每孔 1×10 个接种于激光共聚焦培养皿
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品在230 nm波长处都出现了吸收峰，而PLGA在此波长 中，孵育过夜；待细胞贴壁后，弃去培养基，将细胞分为
下未见明显吸收峰，表明PTX经PLGA包载后，其紫外- 对照组、PTX组、PTX-PLGA-NPs组，每组设置3个复孔。
可见光吸收特征未发生明显改变。 对照组细胞加入新鲜培养基，药物组细胞分别加入含

中国药房 2024年第35卷第22期 China Pharmacy 2024 Vol. 35 No. 22 · 2723 ·