Page 48 - 《中国药房》2024年20期
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2.3 样品采集                                            2.8 统计学方法
              疼痛敏化行为分析结束后，通过戊巴比妥钠麻醉大                              采用 GraphPad Prism 9.0 软件进行分析。计量资料
          鼠，腹主动脉取血，离心后收集上清液，－80 ℃冰箱中保                         经正态性检验，均符合正态分布，以x±s表示，多组间比

          存，备用。随后，迅速断头处死大鼠，收集脊髓组织，各                           较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 SNK-q 检
          组分别取 6 只大鼠的脊髓组织置于 4% 多聚甲醛中固                         验。检验水准α＝0.05。
          定，剩余6只大鼠的脊髓组织置于液氮中保存，备用。                            3 结果
          2.4 血清中炎症及疼痛相关因子水平检测                                3.1 穿心莲内酯对大鼠疼痛敏化行为的影响
              采用 ELISA 法检测。取“2.3”项下各组大鼠的血清                        造模前，各组大鼠的MWT、TWL比较，差异均无统
                                                              计学意义（P＞0.05）。造模后给药前，与假手术组比较，
          样本，按试剂盒说明书操作，检测血清中 IL-6、TNF-α、
          PGE2、SP水平。                                          其余各组大鼠的MWT、TWL均显著降低（P＜0.05）。给
                                                              药 7、14 d 时，与假手术组比较，模型组大鼠的 MWT、
          2.5 大鼠脊髓组织病理形态观察
                                                              TWL 均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，穿心莲内
              取“2.3”项下固定的大鼠脊髓组织，以石蜡包埋，切
                                                              酯-L 组、穿心莲内酯-M 组、穿心莲内酯-H 组、阿魏酸钠
          成厚度为3 μm的切片，经二甲苯脱蜡后，依次用100%、
                                                              组大鼠的 MWT、TWL 均显著升高（P＜0.05），且穿心莲
          90%、80%、70% 乙醇水化，再用磷酸盐缓冲液冲洗切片
                                                              内酯的作用呈剂量依赖性（P＜0.05）；穿心莲内酯-H 组
          5 min，经 HE 染色、干燥、封片后，采用光学显微镜观察
                                                              与阿魏酸钠组大鼠的 MWT、TWL 比较，差异无统计学
          大鼠脊髓组织的病理形态并拍照。
                                                              意义（P＞0.05）。结果见表2、表3。
          2.6 大鼠脊髓组织中Iba-1、Gas6、Axl mRNA表达检测
                                                                  表2 各组大鼠的MWT比较（x±s，n＝12，s）
              取“2.3”项下液氮中保存的大鼠脊髓组织适量，破碎                                                           给药
                                                              分组          造模前     造模后给药前
          后提取 RNA。用 DNase I 处理 RNA 以避免 DNA 污染，                                                7 d      14 d
                                                              假手术组       23.26±2.15  23.38±2.02  23.50±2.14  23.59±2.13
          评估总 RNA 纯度，反转录合成 cDNA，并进行扩增。
                                                              模型组        24.07±2.12  5.01±0.95 a  8.36±1.05 a  10.23±1.06 a
          PCR反应体系为PCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各                穿心莲内酯-L组   23.24±2.21  5.55±1.03 a  12.53±1.12 b  13.85±1.18 b
          0.5 μL，cDNA2 μL，加双蒸水至 20 μL。实时荧光定量                  穿心莲内酯-M组   23.28±2.19  5.37±0.88 a  16.18±1.09 bc  17.94±1.24 bc
                                                              穿心莲内酯-H组   23.60±2.34  5.21±1.05 a  20.84±1.13 bcd  22.56±1.31 bcd
          PCR 反应条件为 96 ℃预变性 10 min；96 ℃变性 15 s，               阿魏酸钠组      23.39±2.16  5.35±1.01 a  20.76±1.17 b  22.68±1.23 b
          56 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH                    a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与穿心
          为内参，采用2     －ΔΔCt 法计算Iba-1、Gas6、Axl mRNA的表达         莲内酯-L组比较，P＜0.05；d：与穿心莲内酯-M组比较，P＜0.05。
          量。引物由南京钟鼎生物技术有限公司设计、合成，引                                表3 各组大鼠的TWL比较（x±s，n＝12，s）
                                                                                                  给药后
          物序列与产物大小见表1。                                        分组          给药前     造模后给药前
                                                                                              7 d      14 d
                      表1 引物序列与产物大小                            假手术组       17.83±1.14  17.69±1.12  17.83±1.15  18.24±1.16
           基因    正向引物（5′→3′）        反向引物（5′→3′）     产物大小/bp   模型组        18.04±1.10  4.01±0.95 a  4.67±1.01 a  5.98±1.02 a
           Iba-1  GCAGCCTCATCGTCATCT  CTCTCTTCCTGTTGGGCTT  118  穿心莲内酯-L组  17.75±1.12  3.82±0.91 a  7.32±1.09 b  8.13±1.04 b
           Gas6  AGCTGAGTTTGACTTCCGGA  CTTGATGACCAGATTCCGCG  223  穿心莲内酯-M组  17.84±1.08  3.99±0.87 a  11.49±1.15 bc  12.35±1.15 bc
           Axl   GCCAGTGGCATGGAGTATC  TACGTCCCTGGCGGTAGTAG  154  穿心莲内酯-H组  17.95±1.15  4.06±0.93 a  15.80±1.23 bcd  16.79±1.20 bcd
           GAPDH  GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA  AATGAAGGGGTCATTGATGG  109  阿魏酸钠组  18.01±1.17  3.88±0.89 a  15.94±1.26 b  16.97±1.23 b
                                                                 a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与穿心
          2.7 大鼠脊髓组织中Iba-1、Gas6、Axl蛋白表达检测
                                                              莲内酯-L组比较，P＜0.05；d：与穿心莲内酯-M组比较，P＜0.05。
              取“2.6”项下剩余的大鼠脊髓组织，裂解后，提取总
                                                              3.2 穿心莲内酯对大鼠血清中炎症及疼痛相关因子水
          蛋白质，采用二辛可宁酸法测定蛋白浓度后，加热变性。
                                                              平的影响
          取变性蛋白样品 20 μg，电泳分离并转移到聚偏氟乙烯                             与假手术组比较，模型组大鼠血清中 IL-6、TNF-α、
          膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h，加入 Iba-1、Gas6、Axl、               PGE2、SP 水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，穿
          GAPDH 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），4 °C 孵育过夜；                 心莲内酯-L 组、穿心莲内酯-M 组、穿心莲内酯-H 组、阿

          加入相应二抗（稀释比例为1∶1 000），室温孵育90 min。                    魏酸钠组大鼠血清中IL-6、TNF-α、PGE2、SP水平均显著
          按 ECL 检测试剂盒说明书操作，对蛋白信号进行可视                          降低（P＜0.05），且穿心莲内酯的作用呈剂量依赖性
          化，使用Image J软件分析各条带的灰度值，以目的蛋白                       （P＜0.05）；穿心莲内酯-H 组与阿魏酸钠组大鼠血清中
          与内参（GAPDH）的灰度值比值计算 Iba-1、Gas6、Axl 蛋                 IL-6、TNF-α、PGE2、SP 水平比较，差异均无统计学意义
          白的表达量。                                             （P＞0.05）。结果见表4。


          · 2490 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 20                            中国药房  2024年第35卷第20期
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