Page 86 - 《中国药房》2024年13期
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20 μL，继续孵育 4 h 后，弃去培养基。将反应产物甲臜                      2.2.2 肿瘤质量测定
          溶解在 100 μL 二甲基亚砜中，使用酶标仪检测 450 nm                        末次给药2 h后，处死裸鼠，收集瘤块并称重。
          处的吸光度（OD）值，并计算细胞增殖率。细胞增殖率                           2.2.3 肿瘤组织中Ki-67蛋白表达检测
         （%）＝（实验组OD值－空白对照组OD值）/（对照组OD                             采用免疫组化法检测。取出部分肿瘤组织，用PBS
          值－空白对照组OD值）×100%。实验重复3次，每次设                         洗涤，在室温下用 10% 中性甲醛固定过夜，制作石蜡切
          置2个平行。                                              片，切片经梯度乙醇脱水及 3% 过氧化氢灭活内源性过
          2.1.5 细胞凋亡率检测                                       氧化酶后，将切片与Ki-67抗体（稀释比例1∶500）在4 ℃下
              采用流式细胞术检测。取对数生长期的PC3细胞，                         孵育过夜，然后加入羊抗鼠IgG二抗（稀释比例1∶1 000）
          按5×10 个/孔接种在6孔板中，按“2.1.2”项下方法进行                     孵育 2 h。最后，按照二氨基联苯胺试剂盒方法对切片
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          分组处理。培养结束后，在室温下离心（1 000×g，5                         进行染色，在光学显微镜下观察并拍照，阳性细胞呈褐
          min）并收集细胞，将细胞洗涤后，于室温下避光加入 5                         色。应用Image J软件计算Ki-67阳性细胞比例。
          μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI染色，然后在Epics XL型            2.2.4 肿瘤组织中 Akt/MDM2/p53 信号通路相关蛋白
          流式细胞仪上测定细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）＝凋                            表达检测
          亡细胞数/总细胞数×100%。实验重复3次，每次设置2                             将肿瘤组织用裂解液裂解后，提取组织中总蛋白。
          个平行。                                                然后按“2.1.6”项下方法进行 Akt/MDM2/p53 信号通路
          2.1.6 细胞中 Akt/MDM2/p53 信号通路相关蛋白表达                   相关蛋白检测。
          检测                                                  2.3 统计学方法
              采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 PC3 细                   采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。各组实
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          胞，按 2×10 个/孔接种在 6 孔板中，再按“2.1.2”项下方                  验数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，
          法分组处理。培养结束后，收集细胞并加入裂解液，提                            组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          取细胞中总蛋白，采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量，将                            3 结果
          蛋白样品与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺上样缓冲液混                            3.1 细胞实验结果
          合，然后在95 ℃下煮沸5 min，电泳（起始电压为70V，随                     3.1.1 AU对PC3细胞增殖的影响
          后调整为 130V）分离蛋白并转膜（电流 200 mA），用 5%                       与对照组比较，50 μmol/L AU组、100 μmol/L AU组
          脱脂奶粉封闭。将膜与 p-Akt（稀释比例 1∶500）、p-                     细胞克隆形成数、增殖率均显著减少/降低（P＜0.05），
          MDM2（稀释比例 1∶1 000）、p53（稀释比例 1∶500）、Akt              SC79 组细胞克隆形成数、增殖率均显著增加/升高（P＜
         （稀释比例1∶500）、MDM2（稀释比例1∶500）、β-actin（稀                0.05）；100 μmol/L AU+SC79组细胞克隆形成数、增殖率
          释比例1∶1 000）抗体在4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入二抗
                                                              与 100 μmol/L AU 组比较均显著增加/升高（P＜0.05），
         （稀释比例 1∶2 000），在室温下继续孵育 2 h。以化学发
                                                              但与 SC79 组比较均显著减少/降低（P＜0.05）。结果见
          光试剂可视化蛋白，并用Image J软件分析条带灰度值，
                                                              图1、表1。
          以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示
          目的蛋白的表达水平，以 p-MDM2/MDM2、p-Akt/Akt 比
          值表示MDM2、Akt蛋白的磷酸化水平。实验重复3次，
          每次设置2个平行。
          2.2 动物实验
          2.2.1 动物分组与处理
                                                                  A.对照组         B. 50 μmol/L AU组  C. 100 μmol/L AU组
              裸鼠适应性饲养 1 周后开始实验：将 PC3 细胞悬浮
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          于 PBS 溶液中，调整细胞密度为 1×10 个/mL，按 200
          µL/只的剂量皮下注射到 40 只裸鼠的左侧腋窝，建立异
                         [13]
          种移植肿瘤模型 。本研究成功获得 40 只异种移植肿
          瘤裸鼠，其肿瘤直径为 0.5～0.6 cm。将建模成功的 40
          只裸鼠按随机数字表法分为肿瘤组、AU 组、SC79 组、
                                                                         D. SC79组     E. 100 μmol/L AU+SC79组
          AU+SC79组，每组10只。其中，AU组裸鼠灌胃80 mg/kg                           图1 各组细胞的克隆形成情况观察
                                                   [14]
          AU（以PBS为溶剂），同时腹腔注射等体积PBS ；SC79
          组裸鼠腹腔注射 50 mg/kg SC79（以 PBS 为溶剂），同时                 3.1.2 AU对PC3细胞凋亡的影响
                        [15]
          灌胃等体积PBS ；AU+SC79组裸鼠灌胃80 mg/kg AU，                      与对照组[（13.52±1.38）%，n＝6]比较，50 μmol/L
          同时腹腔注射 50 mg/kg SC79；肿瘤组裸鼠灌胃并同时                     AU 组、100 μmol/L AU 组细胞凋亡率[分别为（21.57±
          腹腔注射等体积PBS；每天1次，共21 d。                              2.25）%、（34.05±3.44）%，n＝6]均显著升高（P＜0.05），


          · 1620 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 13                            中国药房  2024年第35卷第13期
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