Page 85 - 《中国药房》2024年13期
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above  indexes  of  nude  mice  in  SC79  group  were  opposite （P＜0.05）.  Compared  with AU  group，  the  tumor  mass，  Ki-67  positive
          expression  and  phosphorylation  levels  of  Akt  and  MDM2  protein  in  tumor  tissues  of  nude  mice  in  AU+SC79  group  were
          significantly  increased （P＜0.05），  while  the  expression  level  of  p53  protein  was  significantly  decreased （P＜0.05）；  however，
          compared  with  SC79  group，  the  changing  trend  of  above  indexes  was  opposite （P＜0.05）.  CONCLUSIONS  AU  can  inhibit  PC
          cell proliferation and tumor growth by inhibiting Akt/MDM2/p53 signaling pathway.
          KEYWORDS    aucubin； Akt/MDM2/p53 signaling pathway； prostate cancer； proliferation； tumor growth



              前列腺癌（prostate cancer，PC）是男性泌尿生殖系统              1.3 动物
          最常见的恶性肿瘤，近几十年来在全球范围内变得越来                               本研究所用动物为 SPF 级健康雄性 BALB/c 裸鼠，
          越普遍，且人口老龄化也是导致 PC 发病率和死亡率急                         共40只，体重（20±2） g，购自北京维通利华实验动物技
          剧上升的因素之一        [1―2] 。早期 PC 以手术治疗为主，雄激            术有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（京）2021-
          素剥夺疗法是治疗晚期 PC 的标准方法，但大多数患者                         0011。购入后，将裸鼠饲养在特定的无病原体的SPF级
                                             [3]
          会表现出耐药性，使该治法受到极大限制 。因此，进一                          动物实验中心，实验环境为 12 h 光/12 h 暗循环、温度
          步了解PC发展的分子机制并寻找更有效的治疗方法至                           22～25 °C、相对湿度55%～60%。饲养期间动物自由饮
          关重要。                                               水和摄食。本研究动物实验符合“3R”原则，并经牡丹江
              桃叶珊瑚苷（aucubin，AU）为环烯醚萜苷类化合物，                   医学院附属红旗医院伦理委员会批准（伦理编号为
                                                     [4]
          具有保护神经、抗炎、保肝、抗肿瘤等多种药理作用 ，且                         20220037）。
          AU毒性低，不易对癌症患者造成二次伤害，是一种非常                          1.4 细胞
                           [5]
          有前途的抗癌药物 。AU 为泌尿系统常用药物车前                               前列腺癌PC3细胞购自美国ATCC公司。
          草的有效成分之一，而车前草可作为 PC 的预防及预后                         2 方法
          用药 ，这提示 AU 可能会影响 PC 发展。蛋白激酶 B                      2.1 细胞实验
              [6]
         （protein kinase B，Akt）是一种经典的细胞内关键分子，                2.1.1 细胞培养
          与肿瘤发生有关 。双微体同源基因 2（murine double                       将 PC3 细胞保存在含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青
                         [7]
          minute 2，MDM2）是调控肿瘤抑制蛋白 p53 活性的重要                  霉素和100 g/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，然后置
          蛋白，也是 Akt 的重要下游靶标，研究发现，激活 Akt 可                    于温度37 ℃、含5%二氧化碳的培养箱中常规孵育。将
          使MDM2发生磷酸化并移位至细胞核，从而抑制p53生                         细胞传代2～3次后用于后续实验。
          物活性，进而影响PC等肿瘤进展             [8―10] 。本研究拟通过体        2.1.2 细胞分组及处理
          内外实验研究 AU 对 PC 的作用，并基于 Akt/MDM2/p53                    取对数生长期的 PC3 细胞，分为对照组、50 μmol/L
          信号通路探讨其具体机制，以期为 AU 治疗 PC 提供                        AU 组、100 μmol/L AU 组、SC79 组、100 μmol/L AU+
          参考。                                                SC79 组。其中，50、100 μmol/L AU 组参考前期实验结
          1 材料                                               果和文献方法 分别以含 50、100 μmol/L AU 的完全培
                                                                          [11]
          1.1 主要仪器                                           养基培养 48 h；SC79 组细胞以含 5 μmol/L SC79 的完全
              本研究所用的主要仪器有DTX880型酶标仪、Epics                    培养基培养 48 h ；100 μmol/L AU+SC79 组细胞以含
                                                                            [12]
          XL 型流式细胞仪（美国 Beckman Coulter 公司），Tanon-            100 μmol/L AU 和 5 μmol/L SC79 的完全培养基培养 48
          5200型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。                           h；对照组细胞以不含药的完全培养基培养48 h。
          1.2 主要药品与试剂                                        2.1.3 细胞克隆能力考察
              本研究所用的主要药品与试剂有：AU原料药（美国                            采用平板克隆实验检测。取对数生长期的 PC3 细
          MedChemExpress 公司，批号 N20151634，纯度 98%），            胞，用胰蛋白酶消化后，按1×10 个/孔接种在6孔板中，
                                                                                         3
          Akt 激活剂 SC79（上海碧云天生物技术股份有限公司，                      按“2.1.2”项下方法进行分组处理（每组设置 6 个复孔）。
          批号 20220806，纯度 97%），荧光素 FITC 标记膜联蛋白                各组继续培养 10 d，每隔 3 d 换液 1 次，随后将细胞在
          Ⅴ（Annexin  Ⅴ -FITC）、碘 化 丙 啶（PI）（美 国 Sigma-         4 ℃的 10% 甲醛中固定 10 min，并用 1% 结晶紫染色 30
          Aldrich 公司），MTT 试剂盒（定州百克赛斯生物科技有                    min，然后置于显微镜下观察。将集落细胞数超过50个
          限公司，批号 CS2905），鼠源细胞核相关抗原（nucleus-                  的记为有效克隆，统计各组细胞克隆形成数。
          associated antigen，Ki-67）、磷酸化 Akt（p-Akt）、磷酸化       2.1.4 细胞增殖率检测
          MDM2（p-MDM2）、p53、Akt、MDM2、β-肌动蛋白（β-                    采用 MTT 法检测。取对数生长期的 PC3 细胞，按
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          actin）单 克 隆 抗 体（英 国 Abcam 公 司 ，批 号 分 别 为           1×10 个/孔接种在 96 孔板中，除按“2.1.2”项下方法设
          ab16667、ab38449、ab170880、ab26、ab215873、ab259265、   置组别外，另设空白对照组[不含细胞，仅含 20 μL 0.01
          ab8226），辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白 G                       mol/L 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）的培
         （IgG）二抗（美国CST公司，批号C0012）。                           养基]。培养结束后，每孔加入 0.5 mg/mL 的 MTT 试剂


          中国药房  2024年第35卷第13期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 13    · 1619 ·
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