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2.5.6 粪便菌群分析                                        表2 造模结束时各组大鼠不同压力下 AWR 评分比较
              采用微生物16S rRNA高通量测序技术对粪便菌群                            [M（P25，P75 ），n＝6，分]
          进行分析，具体检测由苏州帕诺米克斯生物医药科技有                            组别         20 mmHg   40 mmHg   60 mmHg  80 mmHg
          限公司完成，主要包括以下步骤：取“2.4”项下各组大鼠                         对照组        0（0，0.25）  1.00（0.75，1.00）  2.00（1.75，2.00）  3.00（3.00，3.00）
                                                              模型组       1.50（1.00，2.00） a  2.00（2.00，3.00） a  3.50（3.00，4.00） a  4.00（4.00，4.00） a
          的粪便样品适量，以十六烷基三甲基溴化铵法提取其总
                                                              中药组       1.00（1.00，1.00） a  2.00（1.75，3.25） a  3.50（3.00，4.00） a  4.00（3.75，4.00） a
          DNA，评估其浓度和完整性后，以此为模板，应用特定                           阳性对照组     1.00（1.00，2.00） a  2.00（2.00，3.00） a  3.50（3.00，4.00） a  4.00（3.75，4.00） a
          PCR引物（515正向引物为5′-ACTCCTACGGGAGGCA-                     a：与对照组比较，P＜0.01。
          GCA-3′，806 反向引物为 5′-GGACTACHVGGGTWTC-               型组比较，中药组和阳性对照组大鼠的稀便出现率分别
          TAAT-3′）对细菌 16S rRNA V4 区进行扩增。取所得扩                  为 20%、80%，中药组大鼠稀便率和各压力下的 AWR 评
          增产物25 μL，经纯化、回收、定量后，构建微生物多样性                        分均显著降低，各药物组大鼠的小球排出时间均显著延
          测序文库，并在 MiSeq 平台上以 PE250 策略进行测序。                    长（P＜0.01或P＜0.05）。结果见表3、表4。
          对测序结果进行质量评价后，使用 QIIME2 平台对各组
                                                              表3 给药后各组大鼠稀便出现率、稀便率、小球排出时
          大鼠粪便样品中的微生物菌群进行如下分析——（1）                                 间比较（n＝6）
          Alpha 多样性分析：包括丰度指数 Chao 1，多样性指数
                                                              组别       稀便出现率/%      稀便率[M（P 25，P 75）]/%  小球排出时间（x±s）/s
          Shannon、Simpson，进化多样性指数 Faith’s PD，均匀度              对照组         0             0           450.33±27.19
          指数 Pielou’s evenness，覆盖度指数 Good’s coverage；         模型组        100        35.42（31.25，40.00） a  144.50±30.72 a
                                                              中药组         20          0（0，6.25） b   456.50±20.36 b
         （2）物种组成分析：包括门水平下菌群物种组成结构、距
                                                              阳性对照组       80        10.00（0，23.33）  238.17±30.29 c
          离矩阵与主坐标分析（principal co-ordinates analysis，
                                                                 a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组
          PCoA）；（3）物种差异分析：通过LEfSe分析[即将非参数                     比较，P＜0.05。
          Kruskal-Wallis、Wilcoxon 秩 和 检 验 与 线 性 判 别 分 析
                                                              表4 给药后各组大鼠不同压力下 AWR 评分比较[M
         （linear discriminant analysis，LDA）效应量相结合的分析              （P25，P75 ），n＝6，分]
                                                [10]
          手段]，以 LDA 效应量＞2 及 P＜0.05 为标准 筛选优势
                                                              组别         20 mmHg   40 mmHg   60 mmHg  80 mmHg
          菌属。                                                 对照组        0（0，0）  1.00（1.00，2.00）  2.00（1.75，2.25）  3.00（2.75，3.00）
          2.6 统计学方法                                           模型组       2.00（1.00，2.00） a  3.00（2.00，3.00） a  3.00（2.75，4.00） a  4.00（4.00，4.00） a
                                                              中药组       0.00（0.00，1.00） b  1.00（1.00，1.25） b  2.00（1.00，2.25） c  3.00（2.75，3.25） b
              采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。符合正
                                                              阳性对照组     1.00（1.00，2.00）  2.50（1.75，3.00）  3.50（2.75，4.00）  4.00（3.75，4.00）
          态分布且方差齐的计量资料以x±s表示，多组间比较采
                                                                 a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组
          用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；不                         比较P＜0.05。
          符合正态分布或方差不齐的计量资料以 M（P25，P75 ）表
                                                              3.3 痛泻要方对大鼠血清LPS浓度的影响
          示，采用Kruskal-Wallis秩和检验。检验水准α＝0.05。
                                                                  与对照组[（80.37±4.97） ng/L]比较，模型组大鼠血
          3 结果
                                                              清 LPS 浓度[（92.03±3.90） ng/mL]显著升高（P＜0.01）；
          3.1 模型评价                                            经药物干预后，与模型组比较，中药组和阳性对照组血
              造模结束时，对照组大鼠无稀便出现，其余3组大鼠                         清 LPS 浓度[（80.38±4.54）、（78.53±2.72） ng/mL]均显
          均 100% 出现稀便，稀便率显著高于对照组（P＜0.01），                     著降低（P＜0.01）。
          小球排出时间均显著短于对照组（P＜0.01），各压力下                         3.4 痛泻要方对大鼠结肠组织中 BMP2、CSF1、TLR4
          的 AWR 评分均显著高于对照组（P＜0.01）。结果见表                       蛋白表达及分布的影响
          1、表2。                                                   Western blot 实验结果显示，与对照组比较，模型组
          表1 造模结束时各组大鼠稀便出现率、稀便率、小球排                           大鼠结肠组织中 BMP2 蛋白的表达显著下调，CSF1、
               出时间比较（n＝6）                                     TLR4 蛋白的表达显著增加（P＜0.01）；经药物干预后，
           组别       稀便出现率/%     稀便率[M（P 25，P 75）]/%  小球排出时间（x±s）/s  与模型组比较，中药组大鼠结肠组织中BMP2蛋白的表
           对照组         0             0          464.50±23.50  达显著上调，阳性对照组大鼠结肠组织中 CSF1 蛋白的
           模型组        100        35.42（25.00，40.71） a  168.50±33.51 a
           中药组        100        33.33（31.25，40.71） a  139.67±29.53 a  表达显著下调（P＜0.05）。结果见图1。
           阳性对照组      100        38.75（33.33，40.00） a  155.17±42.07 a  免疫组化实验结果显示，与对照组比较，模型组大
             a：与对照组比较，P＜0.01。                                 鼠结肠组织肌层中BMP2蛋白的平均光密度显著下降，
          3.2 痛泻要方对大鼠粪便性质、结肠运动功能、内脏敏                          CSF1、TLR4 蛋白的平均光密度显著升高（P＜0.01）；与
          感性的影响                                               模型组比较，各药物组大鼠结肠组织肌层中BMP2蛋白
              与对照组比较，模型组大鼠稀便出现率为100%，稀                        的平均光密度均显著升高，CSF1、TLR4蛋白的平均光密
          便率显著升高，小球排出时间显著缩短，各压力下的                             度均显著下降（P＜0.05 或 P＜0.01）。结果见图 2（以
          AWR 评分均显著升高（P＜0.01）。经药物干预后，与模                       BMP2蛋白为例）、表5。


          · 1608 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 13                            中国药房  2024年第35卷第13期
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