Page 73 - 《中国药房》2024年13期
P. 73

2.2 分组与造模                                          2.5.2 结肠运动功能
              待雌性SD孕鼠分娩后，随机选取40只新生雄性SD                           采用肠道转运功能实验 ，分别于造模结束及末次
                                                                                      [8]
          大鼠分为对照组、模型组、中药组、阳性对照组，每组 10                        给药结束前1 d，各组大鼠禁食、不禁水24 h，以2%异氟
                                                  [8]
          只。除对照组外，其余组均参照相关文献方法 建立肝                           烷混合纯氧诱导麻醉后取直径为3 mm的玻璃小球沿肛
          郁脾虚证型 IBS-D 模型——（1）母子分离应激：于出生                      门放入距肛门 3 cm 的肠道内，然后单笼饲养，待大鼠完
          后第 2～14 天每天上午 9：00－12：00，将新生大鼠与母                   全苏醒（以大鼠能自由翻身、爬起活动为标准）后开始计
          鼠分离 3 h，然后与母鼠共同饲养至第 24 天断奶；（2）束                    时，记录大鼠直肠内玻璃小球排出时间。实验期间完全
          缚应激：断奶后，将新生大鼠单笼正常喂养，待长至8周                          禁食水。
          龄时，采用束缚器于每天上午 9：00－12：00 对其进行制                     2.5.3 内脏敏感性
          动束缚应激，连续3周；（3）叠加致泻因素：在束缚应激2                            分别于造模结束及末次给药结束第 2 天，各组大鼠
          周后，叠加灌胃番泻叶药液[4.5 g/（kg·d），以生药量计，                   禁食、不禁水 12 h，进行直肠气囊扩张术（colon rectal
                          [7]
          剂量参考相关文献 ]，每天1次，连续2周。对照组新生                         distension，CRD），即将自制的气囊涂抹石蜡油后塞进大
          大鼠不进行上述操作，于第24天断奶，单笼正常喂养至                          鼠肛门内约 6 cm，然后将其放入透明塑料箱中适应 5
                                                [8]
          其余 3 组造模结束。第 12 周，参照相关文献 及本课题                      min，用血压计向气囊内缓慢加压，记录其在 20、40、60、
          组前期实验方法，通过检测大鼠粪便性质、结肠运动功                           80 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）压力下的腹部回缩反射
                                                            （abdominal withdrawal reflex，AWR）评分，每个压力条件
          能、内脏敏感性来判断肝郁脾虚证型IBS-D模型是否复
                                                             平行检测 3 次取平均值，每次测量间隔 5 min。AWR 评
          制成功（由于在结肠运动功能、内脏敏感性实验中，模型
                                                             分标准如下——0 分：大鼠在接受直肠扩张时无行为学
          组有4只大鼠因操作不当造成结肠黏膜损伤，无法进行
                                                             反应；1分：身体静止不动，头部运动减少；2分：大鼠腹部
          后续检测，故并未纳入数据统计；其余组别均平行剔
                                                             肌肉轻微收缩，腹部不抬离平面；3分：腹肌强烈收缩，腹
          除4只）。
                                                                                               [9]
                                                             部抬离平面；4级：骨盆抬起，身体呈弓形 。
          2.3 药物干预
                                 [7]
              造模后，参照相关文献 方法折算痛泻要方的剂量，                        2.5.4 血清LPS浓度
                                                                 取“2.4”项下各组大鼠血清样品，按相应试剂盒说明
          中药组大鼠灌胃痛泻要方药液2.68 g/（kg·d）（以生药量
                                                             书方法操作，采用 ELISA 法以荧光分析仪检测其血清
          计）；根据双歧杆菌乳杆菌三联活菌片药品说明书推荐
                                                             LPS浓度。
          的成人用量（6 g/d）以及人和动物体表面积折算等效剂
                                                             2.5.5 结肠组织中BMP2、CSF1、TLR4蛋白的表达及分布
          量，阳性对照组大鼠灌胃益生菌混悬液 0.27 g/（kg·d）；
                                                                 采用 Western blot 法检测大鼠结肠组织中 BMP2、
          对照组和模型组大鼠灌胃等体积水 ；每天 1 次，持
                                                             CSF1、TLR4蛋白的表达情况。取“2.4”项下冻存的各组
          续2周。
                                                             大鼠结肠组织适量，匀浆后，加入RIPA裂解液提取总蛋
          2.4 样本采集与处理                                        白，以 BCA 法进行蛋白定量，并于 95 ℃下加热变性 10
              末次给药结束前 2 d，收集各组大鼠 24 h 粪便，于
                                                             min。取变性蛋白适量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
          －80 ℃保存，备用。末次给药结束第 2 天（完成相关实
                                                             胺 凝 胶 电 泳 分 离 后 转 膜 ，封 闭 ；加 入 BMP2、CSF1、
          验后），采集尾静脉血 0.5 mL，静置 2 h 后，于 4 ℃下以
                                                             TLR4、β-tubulin一抗（稀释度均为 1∶1 000），4 ℃下孵育
          3 000 r/min 离心 15 min，得血清；随后，大鼠经二氧化碳               过夜；TBST 缓冲液洗膜后，加入相应二抗（稀释度均为
          麻醉后以颈椎脱臼法处死，迅速打开腹腔，截取近端结                           1∶5 000），室温下孵育 1 h；加入 ECL 化学发光试剂，室
          肠组织2段（每段长3 cm），其中一段用生理盐水洗净后                        温下反应 1～2 min 后成像。以 β-tubulin 为内参，采用
          置于冻存管中，经液氮冷冻后于－80 ℃下储存，备用；另                        Image J软件分析目的蛋白的表达水平，结果以对照组为
          一段置入10%中性甲醛溶液中固定，备用。                               参照进行归一化处理。
          2.5 相关指标检测                                             采 用 免 疫 组 化 法 检 测 大 鼠 结 肠 组 织 中 BMP2、
          2.5.1 粪便性质                                         CSF1、TLR4蛋白的分布情况。取“2.4”项下各组大鼠经
              分别于造模结束及末次给药结束前2 d统计各组大                        固定的结肠组织，经脱水、浸蜡、包埋后，制成石蜡切片。
          鼠的稀便率及稀便出现率，具体方法如下——（1）稀便                          切片经脱蜡水化后，行抗原修复、羊血清白蛋白封闭
                         [8]
          率：参考相关文献 ，将各组大鼠单笼饲养，于笼底垫置                          等操作，加入 BMP2、CSF1、TLR4 一抗（稀释度分别为
          滤纸，统计其末次灌胃后6 h内的排便总数和稀便数（干                         1∶200、1∶500、1∶200），4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相
          稀便的区分以滤纸上有无污迹为标准），计算稀便率[稀                          应二抗（稀释度均为1∶100），室温下孵育20 min；以DAB
          便率（%）＝稀便数/总排便粒数（若 0.5 h 内无排便自动                     显色、苏木精复染后，使用显微镜观察各蛋白的分布情
          计 1）×100%]。（2）稀便出现率：记录大鼠出现稀便的情                     况。选取包含完整结肠肌层的视野，使用 Image J 软件
          况，计算稀便出现率[稀便出现率（%）＝出现稀便大鼠                          分析各蛋白阳性表达区域（棕色）的平均光密度值，以表
          数/总大鼠数×100%]。                                      示其表达情况。


          中国药房  2024年第35卷第13期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 13    · 1607 ·
   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78