Page 45 - 《中国药房》2024年13期
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肿瘤细胞对顺铂的敏感性将有助于改善宫颈癌患者的                            83669S、4022S、9661S、9662S、4967S、7074S）均购自美
          治疗结局。                                              国CST公司；重组兔增殖细胞相关抗原Ki67抗体（批号
              藁本内酯是当归、川芎挥发油的主要成分，具有抗                         为ab16667）购自英国Abcam公司。
                                 [3]
          炎、抗肿瘤等多种药理活性 。研究表明，藁本内酯具有                          1.3 细胞
          抗肿瘤作用，可恢复肺癌细胞对顺铂的敏感性，为中药                               人宫颈癌顺铂耐药细胞 HeLa/DDP（批号 CL0677）
                                    [4]
          治疗顺铂耐药肺癌提供了可能 。Hippo 信号通路可通                        购自湖南丰晖生物科技有限公司。
          过促进细胞凋亡和抑制细胞增殖来控制组织生长，其表                           2 方法
                                     [5]
          达异常会导致组织过度增殖 。Yes 相关蛋白（Yes-                        2.1 细胞培养
          associated protein，YAP）/具有PDZ结合基序的转录共激                 取 HeLa/DDP 细胞，接种于含 1% 青-链霉素双抗和
          活因子（transcriptional coactivator with PDZ binding mo‐  10%胎牛血清的DMEM培养基（以下称“完全培养基”）
          tif，TAZ）是 Hippo 信号通路级联的下游效应因子，其异                   中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。
                                         [6]
          常激活可引起肿瘤细胞的过度增殖 ，因此 Hippo-YAP                      2.2 HeLa/DDP细胞增殖情况检测
          信号通路在肿瘤领域备受学者关注，其抑制剂有望成为                               采用 CCK-8 法检测。取对数生长期的 HeLa/DDP
                                [7]
          肿瘤治疗的候选药物之一 。研究表明，YAP 在控制宫                         细胞，接种于96孔板中，常规培养过夜后，将细胞分为对
                                                                                      [10]
          颈癌进展中具有核心作用，其低表达与宫颈癌患者预后                           照组、顺铂组（10 μmol/L顺铂 ）和顺铂+低、中、高浓度
          不良有关 ，提示靶向 Hippo-YAP 信号通路可调控宫颈                     藁本内酯组（10 μmol/L顺铂+25、50、100 μmol/L藁本内
                  [8]
          癌的发展。此外有实验证实，Hippo-YAP信号通路与肿                       酯，藁本内酯的剂量参考文献[11]和前期预实验结果设
          瘤耐药有关，抑制该通路可提高卵巢癌耐药细胞对顺铂                           置），每组设置6个复孔。对照组细胞加入完全培养基，
                  [9]
          的敏感性 。基于以上证据，本研究以宫颈癌顺铂耐药                           其余各组加入含相应药液的完全培养基。培养24 h，每
          细胞HeLa/DDP为对象，从Hippo-YAP信号通路出发，初                   孔加入 CCK-8 试剂 10 μL，孵育 2 h 后，使用酶标仪于
          步探究藁本内酯对宫颈癌耐药细胞的影响及潜在机制，                           450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，并计算增殖
          以期为宫颈癌新型治疗药物的研发提供参考。                               抑制率[增殖抑制率＝（1－实验组 OD 值）/对照组 OD
          1 材料                                               值×100%]。
          1.1 主要仪器                                           2.3 HeLa/DDP细胞凋亡情况检测
              本研究所用主要仪器包括SpectraMax  Paradigm型                   采用流式细胞术检测。取对数生长期的HeLa/DDP
                                              ®
          酶标仪（美国 Molecular Devices 公司），Attune CytPix 型       细胞，接种于 96 孔板中，按“2.2”项下方法分组、干预。
          流 式 细 胞 仪 、E-Gel  Imager 型 凝 胶 成 像 系 统（美 国         培养 24 h，收集细胞，经磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗后重
          Thermo Fisher Scientific 公司），BX53M 型显微镜（日本         悬；取上述细胞悬液100 μL，依次加入Annexin Ⅴ-FITC
          Olympus公司）等。                                       染液和 PI 染液各 5 μL，混匀，室温下避光孵育 15 min
          1.2 主要药品与试剂                                        后，使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率（即早期凋亡、
              藁本内酯原料药（批号 HY-N0401A，纯度 99.17%）、               晚期凋亡细胞之和与总细胞数的比值）。
          顺铂对照品（批号 HY-17394，纯度 99.84%）、ECL 试剂                2.4 HeLa/DDP细胞迁移能力检测
         （批号 HY-K1005）均购自美国 MedChemExpress 公司；                   采用划痕实验检测。取对数生长期的HeLa/DDP细
          DMEM培养基（批号BC-M-030）购自南京森贝伽生物科                      胞，经消化后重悬并接种于24孔板中，于各孔底部划线，
          技有限公司；Trizol 试剂（批号 B511311-0100）购自生工               用 PBS 清洗后，将细胞按“2.2”项下方法分组、干预。使

          生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8 试剂盒（批号                        用显微镜分别在培养 0、48 h 时记录各组细胞的划痕愈
          CK04）购自日本 Dojido 公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞           合情况，采用 Image J 软件分析并计算各组细胞的划痕
          凋亡检测试剂盒（批号 40302ES60）、RIPA 裂解液（批号                  愈合率[划痕愈合率＝（0 h 时的划痕面积－24 h 时的划
          20101ES60）均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；                     痕面积）/0 h时的划痕面积×100%]。
          兔源 YAP、TAZ、基质金属蛋白酶 2（matrix metallopro‐            2.5 HeLa/DDP细胞侵袭能力检测
          teinase 2，MMP2）、切割型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-             采用 Transwell 实验检测。取对数生长期的 HeLa/
          3）、caspase-3、β-肌动蛋白（β-actin）抗体和辣根过氧化物              DDP 细胞，经消化后重悬并接种于预先用 matrigel 胶处
          酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号分别为4912S、                        理 的 Transwell 小 室 的 上 层 ；取 含 10% 胎 牛 血 清 的


          中国药房  2024年第35卷第13期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 13    · 1583 ·
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