Page 65 - 《中国药房》2024年12期
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至膀胱功能恢复。当造模大鼠受撞击处的脊髓出现水                            2.6 大鼠脊髓组织中氧化应激因子水平检测
          肿、出血且硬脊膜呈紫红色时，表示 SCI 模型制备成                             取“2.4”项下冻存的各组5只大鼠的脊髓组织适量，
            [7]
          功 。假手术组大鼠仅暴露脊髓，不进行撞击实验。                            以 PBS 匀浆，在 4 ℃下以 1 000×g 离心 10 min，取上清
          2.2 动物分组与给药                                        液，按相应试剂盒说明书方法操作，采用 TBA 微板法以
              将造模成功的 60 只大鼠（造模过程中死亡 5 只）随                    酶标仪检测其脊髓组织中 MDA 水平，采用微量法以超
          机分为模型组、CUR 低剂量组、CUR 高剂量组、CUR 高                     微量分光光度计检测SOD、GSH水平。
          剂量+3-MA组，每组15只。CUR低、高剂量组大鼠分别                       2.7 大鼠脊髓组织中BDNF、GFAP蛋白表达检测
                                                 [4]
          灌胃 CUR 36、72 mg/kg（以生理盐水为溶剂） ，同时腹                      采用免疫组化法检测。取“2.4”项下各组大鼠的脊
          腔注射生理盐水；CUR 高剂量+3-MA 组大鼠先灌胃                        髓组织切片，脱蜡、水化后进行抗原修复，然后以 5% 牛
          CUR 72 mg/kg，30 min后再腹腔注射3-MA 20 mg/kg（以           血清白蛋白封闭30 min；洗涤后，分别加入BDNF、GFAP
                         [8]
          生理盐水为溶剂） ；每天1次，持续28 d。假手术组和模                       一抗（稀释比例均为 1∶500），于 4 ℃下孵育过夜；洗涤
          型组大鼠均以灌胃和腹腔注射的方式给予等体积生理                            后，加入相应二抗（稀释比例为1∶500），于室温下孵育1
          盐水。                                                h；经DAB显色、脱水透明后以中性树脂封片，使用光学
          2.3 大鼠神经功能和运动功能评估                                  显微镜观察大鼠脊髓组织中 BDNF、GFAP 蛋白的表达
              分别在给药后第 14、28 天对各组大鼠进行 Basso-                  情况。每张切片任选 5 个视野，利用 Image-Pro Plus 6.0
          Beattie-Bresnahan（BBB）评分和Rivlin斜板实验，以分别            软件分析并检测阳性区域（呈棕色或深棕色）的光密度
          评估其神经功能和运动功能。（1）BBB评分共有22个等                        值（取平均值），用以表示 BDNF、GFAP 蛋白的表达水
          级（即0～21分），0分表示后肢完全瘫痪，21分表示后肢                       平，结果以假手术组为参照进行归一化处理。
          完全正常。评分前，将各组大鼠置于空旷平地上适应性                           2.8 大鼠脊髓组织中通路及自噬相关蛋白表达检测
          活动 3 min，然后观察其后肢情况，分别对左、右后肢进                           采用Western blot法检测。取“2.4”项下冻存的各组
          行评分，取平均值。（2）Rivlin斜板实验的具体操作如下：                     剩余 5 只大鼠的脊髓组织适量，以 RIPA 蛋白裂解液裂
          将各组大鼠横向放置于水平的木板上，以5°为梯度值逐                          解、匀浆，以 8 000×g 离心 15 min，收集上清液，以 BCA
          渐增大木板的倾斜角度，测量其在木板上停留 5 s 且不                        法测定蛋白浓度后将其煮沸变性。取变性蛋白样品适
          掉落的最大斜板角度，重复测量3次并取平均值。                             量，进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳分离并
          2.4 大鼠脊髓组织病理学观察                                    转移到聚偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂牛奶封闭 1 h；洗
              采用 HE 染色法观察。末次运动功能测试结束后，                       膜后，加入通路相关蛋白（PINK1、Parkin）、自噬相关蛋
          各组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉并断                      白（p62、LC3）、内参蛋白（GAPDH）一抗（稀释比例分别
                                                      3
          颈处死，剖开背部并以脊髓损伤部位为中心取 1 cm 的                        为 1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶500、1∶2 500），于 4 ℃
          脊髓组织（假手术组大鼠取相同部位脊髓组织，下同）。                          下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例均为
          每组取 5 只大鼠的脊髓组织固定于 4% 多聚甲醛中；另                       1∶500），于室温下孵育2 h；经ECL显影后于凝胶成像系
          10 只大鼠的脊髓组织冻存于－80 ℃下，备用。取固定                        统成像。使用 Image J 软件分析各蛋白的条带灰度值，
          于 4% 多聚甲醛（24 h）中的大鼠脊髓组织，脱水后制备                      以 PINK1、Parkin、p62 与内参蛋白的条带灰度值比值表
          石蜡切片（厚度4 μm）；切片经常规脱蜡、水化后进行HE                       示PINK1、Parkin、p62蛋白的表达水平，以LC3Ⅱ与LC3
          染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后行乙醇梯度脱水和                         Ⅰ蛋白的条带灰度值比值（LC3Ⅱ/Ⅰ比值）表示 LC3 蛋
          二甲苯透明，清洗、晾干并以中性树脂封片，使用光学显                          白的表达情况。
          微镜观察各组大鼠脊髓组织的病理学变化。                                2.9 统计学方法
          2.5 大鼠脊髓组织中细胞凋亡情况检测
                                                                 采用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分
              采用TUNEL染色法检测。取“2.4”项下各组大鼠的
                                                             析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
          脊髓组织切片，经脱蜡、水化后按照TUNEL细胞凋亡检
                                                             分析，进一步两两比较采用 SNK-q 检验。检验水准
          测试剂盒说明书方法操作，加入现配的 TUNEL 工作液
                                                             α＝0.05。
          50 μL，于37 ℃下孵育1 h；用PBS清洗，再加入4′，6-二
          脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液适量，避光孵育 5 min；用                   3 结果
          PBS 清洗，以含抗荧光淬灭剂的封片剂封片，使用倒置                         3.1 CUR对SCI大鼠神经功能和运动功能的影响
          荧光显微镜观察神经元染色情况并按下式计算凋亡率：                               给药后第14、28天，与假手术组比较，模型组大鼠的
          凋亡率（%）＝凋亡阳性细胞（呈绿色）数/细胞总数×                          BBB 评分和斜板角度均显著降低或减小（P＜0.05）；与
          100%。每张切片任选5个视野观察、计数，取平均值。                         模型组比较，各药物组大鼠的BBB评分和斜板角度均显


          中国药房  2024年第35卷第12期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 12    · 1471 ·
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