Page 33 - 《中国药房》2024年12期

2.2 动物分组干预及取材 表1 引物序列和产物大小
30 只 ApoE －/－ 小鼠采用随机数字表法分为模型组、 基因名称 序列（5′-3′） 产物大小/bp
IκB 正向引物TACGCCCCAGCATCTCCACTCCG 123
化瘀祛痰方组、瑞舒伐他汀组，每组 10 只；10 只 C57BL/
反向引物CTCCACGATGCCCAGGTAGCCAT
6J 小鼠作为正常对照组。参照文献方法 [10―11] 给予 30 只 NF-κB 正向引物GCGCATCCAGACCAACAATAAC 108
ApoE －/－ 小 鼠 高 脂 饲 料 喂 养 12 周 以 复 制 AS 模 型 ， 反向引物GCCGAAGCTGCATGGACACT
NLRP3 正向引物CATCAATGCTGCTTCGACAT 126
ApoE －/－ 小鼠主动脉经 HE 染色后在显微镜下可观察到 反向引物TCAGTCCCACACACAGCAAT
根部内膜有斑块形成，即AS造模成功；正常对照组的小 Caspase-1 正向引物CACAGCTCTGGAGATGGTGA 136
反向引物GGTCCCACATATTCCCTCCT
鼠用普通饲料喂养。根据人与动物体表面积折算系数 IL-1β 正向引物GCTGCTTCCAAACCTTTGAC 152
和临床常用剂量换算，化瘀祛痰方组及瑞舒伐他汀组小 反向引物AGCTTCTCCACAGCCACAAT
IL-18 正向引物GACTCTTGCGTCAACTTCAAGG 163
鼠给药剂量分别为20 g/（kg·d）及1.55 mg/（kg·d），模型组
反向引物CAGGCTGTCTTTTGTCAACGA
及正常对照组小鼠给予等体积生理盐水。造模成功后， GAPDH 正向引物GTCAAGAAAGTGGGGCCTGA 132
各组小鼠每日灌胃1次，每次0.5 mL，连续4周。在给药 反向引物TGAGTGGAATCTGGGATTGTG
期间，各组小鼠喂养饲料不变。各组小鼠在末次灌胃结 2.7 小鼠主动脉组织中IκB、NF-κB、NLRP3、ASC、Cas‐
束后，禁食不禁水12 h后，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠0.2 pase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平检测
mL 进行麻醉，随后眼眶取血 200～300 μL，离心（4 000 采用 Western blot 法检测。取各组 3 只小鼠冻存的
r/min，15 min），取血清置于干净的离心管，冻存于－80 ℃ 主动脉组织 100 mg，加入 RIPA 裂解液 1 mL，在冰上裂

冰箱中，备用。取血后处死小鼠，固定于解剖板上，剖离 解28 min，离心（4 ℃，12 000 r/min，10 min）。取上清液，
应用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，变性后电泳、
小鼠主动脉组织，每组取 3 只小鼠的主动脉组织用 4%
转膜，加入5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，再加入IκB、NF-
多聚甲醛固定，其余小鼠的主动脉组织冻存于－80 ℃冰
κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、
箱中，备用（部分小鼠用于其他实验）。
β-actin 一抗（稀释比例分别为1∶5 000、1∶5 000、1∶1 000、
2.3 小鼠血脂水平检测
1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000），
取各组小鼠血清，参照试剂盒说明书进行操作，采
4 ℃封闭过夜；用 TBST 缓冲液洗涤 3～4 次，加入二抗
用 全 自 动 生 化 分 析 仪 检 测 TC、TG、LDL-C、HDL-C
（稀释比例为 1∶10 000），室温孵育 1 h；用 TBST 缓冲液
水平。
洗涤3次，ECL发光液显色曝光，于化学发光成像系统下
2.4 小鼠主动脉组织形态学变化观察
成像。利用Alpha View软件对条带进行分析，以目的蛋
取各组小鼠固定于 4% 多聚甲醛中的主动脉组织，
白和内参蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的表
梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋，制备石蜡切片（4 μm），
达水平。
脱蜡后进行HE染色，脱水封片，在光学显微镜下观察各
2.8 统计学方法
组小鼠主动脉组织形态学变化，并拍照。
采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以x±
2.5 小鼠血清中EETs、IL-1β、IL-18水平检测
s 表示。多组数据比较采用单因素方差分析，组间两两
取各组小鼠血清，参照ELISA检测试剂盒说明书进
比较用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
行操作，用酶标仪检测其中 5，6-EET、8，9-EET、11，12-
3 结果
EET、14，15-EET、IL-1β、IL-18水平。
3.1 各组小鼠血脂水平比较
2.6 小鼠主动脉组织中IκB、NF-κB、NLRP3、Caspase-
与正常对照组比较，模型组小鼠血清中 TC、TG、
1、IL-1β、IL-18 mRNA表达水平检测
LDL-C 水平均显著升高（P＜0.05），HDL-C 水平显著降
采用实时荧光定量 PCR 法检测。取各组 3 只小鼠
低（P＜0.05）；与模型组比较，化瘀祛痰方组及瑞舒伐他
冻存的主动脉组织200 mg，提取总RNA，检测总RNA浓
汀组小鼠血清中 TC、TG、LDL-C 水平均显著降低（P＜
度，反转录为 cDNA。PCR 条件为 95 ℃预变性 30 s；
0.05）。结果见表2。
95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 40 个
表2 各组小鼠的血脂水平比较（x±s，n＝10，mmol/L）
循环；最后72 ℃再延伸5 min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶
组别 TC TG LDL-C HDL-C
（GAPDH）为内参，应用2 －ΔΔCt 法计算主动脉组织中IκB、 正常对照组 3.14±0.80 1.46±0.15 0.56±0.08 1.14±0.12
NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 表达水 模型组 16.13±1.51 a 3.69±0.20 a 3.10±0.39 a 0.77±0.08 a
化瘀祛痰方组 11.32±1.05 b 2.67±0.19 b 1.42±0.11 b 0.82±0.05
平，并以正常对照组为参照进行归一化处理。引物序列 瑞舒伐他汀 9.52±1.22 b 2.19±0.32 b 1.23±0.09 b 0.83±0.04
和产物大小见表1。 a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。

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