Page 79 - 《中国药房》2024年11期
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从激发第7天开始，吴茱萸碱低、高剂量组大鼠于激发前                          半干法转膜（90 min），以脱脂奶粉封闭1 h；洗膜后，加入
          30 min（下同）分别灌胃 10、20 mg/kg 吴茱萸碱（以 0.5%             通路相关蛋白（p-p38 MAPK、p38 MAPK、STAT1）、凋亡
                                    [12]
          羧甲基纤维素钠溶液为溶剂） ，并同时腹腔注射等体                           相关蛋白（Bcl-2、Bax）、内参（GAPDH）一抗（稀释比例均
          积生理盐水；地塞米松组大鼠灌胃 0.5 mg/kg 地塞米松                     为1∶1 500），4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀
                                          [10]
         （以0.5%羧甲基纤维素钠溶液为溶剂） ，并腹腔注射等                         释比例为 1∶3 000），室温下孵育 4 h。以 ECL 曝光显色
          体积生理盐水；EGF组大鼠腹腔注射10 μg EGF（以生理                     并成像后，使用Image Lab 5.2.1软件进行灰度值分析，以
                     [13]
          盐水为溶剂） ，并灌胃等体积 0.5% 羧甲基纤维素钠溶                       GAPDH 为内参计算目的蛋白的表达水平（即目的蛋白
          液；吴茱萸碱高剂量+EGF 组大鼠腹腔注射 10 μg EGF，                   与内参蛋白的条带灰度值比值），并计算p-p38 MAPK与
          并灌胃 20 mg/kg 吴茱萸碱；对照组和模型组大鼠灌胃
                                                             p38  MAPK 表 达 水 平 的 比 值（即 p-p38  MAPK/p38
          0.5% 羧甲基纤维素钠溶液，并腹腔注射等体积生理盐                         MAPK）以及 Bcl-2 与 Bax 表达水平的比值（即 Bcl-2/
          水；每天1次，连续14 d。
                                                             Bax）。
          2.2 标本收集                                           2.8 统计学方法
              末次给药后 12 h，对各组大鼠腹腔注射 2% 戊巴比
                                                                 采用 GraphPad Prism 9.0 软件对数据进行统计分
          妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，采集其颈动脉血 4 mL，离心
                                                             析。符合正态分布的计量数据以x±s表示，多组间比较
          后取上层血清，于－80 ℃下冻存，备用。采血后，将大鼠
                                                             采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 SNK-q 检
          以仰卧位固定于手术台上，在其颈部中央处做一切口，
                                                             验。检验水准α＝0.05。
          游离气管并插管，从气管插管处注入生理盐水（2 mL）灌
          洗左肺，30 s 后回收支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar               3 结果
          lavage fluid，BALF），重复 3 次；取 BALF，离心后取上清            3.1 各组大鼠BALF中炎症细胞计数比较
          液，合并，混匀，于－80 ℃下冻存，备用。随后，各组大鼠                           与对照组比较，模型组大鼠 BALF 中巨噬细胞数、
          以脊椎脱臼法处死，分离肺组织，其中右肺组织固定于                           淋巴细胞数均显著增多（P＜0.05）。与模型组比较，吴
          4% 多聚甲醛中约 6 h，用于 HE 和 TUNEL 染色实验；左                 茱萸碱低、高剂量组和地塞米松组大鼠BALF中上述细
          肺组织于－80 ℃下冻存，用于Western blot检测。                     胞数均显著减少，且吴茱萸碱高剂量组、地塞米松组均
          2.3 大鼠BALF中炎症细胞数检测                                 显著少于吴茱萸碱低剂量组（P＜0.05）；而 EGF 组大鼠
              采 用 瑞 氏 染 色 法 检 测 。 取“2.2”项 下 各 组 大 鼠          BALF 中上述细胞数均显著增多（P＜0.05）。与吴茱萸
          BALF适量，进行瑞氏染色，使用显微镜观察巨噬细胞和                         碱高剂量组比较，吴茱萸碱高剂量+EGF 组大鼠 BALF
          淋巴细胞并计数。                                           中上述细胞数均显著增多（P＜0.05）。结果见表1。
          2.4 大鼠肺组织病理变化观察                                    表1 各组大鼠BALF中炎症细胞数比较（x±s，n＝10，
              采用 HE 染色法观察。取“2.2”项下各组大鼠固定                          个/mL）
          好的肺组织适量，经脱水（室温）、石蜡包埋后切片（厚约                          组别                   巨噬细胞（×10）      淋巴细胞（×10）
                                                                                                         6
                                                                                         6
          5 μm）。取上述切片，进行HE染色，使用显微镜观察大                         对照组                   13.25±1.09      5.13±0.41
          鼠肺组织病理变化并拍照。                                        模型组                   62.32±5.63 a   59.67±4.96 a
                                                              吴茱萸碱低剂量组              37.26±3.05 b   28.54±2.31 b
          2.5 大鼠肺组织中气道上皮细胞凋亡检测
                                                              吴茱萸碱高剂量组              19.42±1.32 bc  14.11±1.23 bc
              采用TUNEL染色法检测。取“2.4”项下各组大鼠的                      地塞米松组                 18.71±1.27 bc  14.56±1.31 bc
          肺组织切片，按照相应试剂盒说明书方法进行 TUNEL                          EGF组                  81.81±6.25 b   78.92±5.89 b
          染色，使用显微镜观察大鼠肺组织中气道上皮细胞的凋                            吴茱萸碱高剂量+EGF组          31.15±2.84 d   27.89±2.45 d
                                                                a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与吴茱萸
          亡情况（阳性染色细胞呈棕黄色）并拍照，按下式计算细
                                                             碱低剂量组比较，P＜0.05；d：与吴茱萸碱高剂量组比较，P＜0.05。
          胞凋亡率：细胞凋亡率（%）＝TUNEL 阳性染色细胞数/
                                                             3.2 各组大鼠肺组织病理变化比较
          细胞总数×100%。
                                                                 与对照组比较，模型组大鼠肺组织可见支气管黏膜
          2.6 大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-4水平检测
                                                             水肿、肺泡间隔增厚、气道管腔狭窄、部分气道上皮细胞
              采用 ELISA 法检测。取“2.2”项下各组大鼠的血清
          适量，按照相应试剂盒说明书操作，以酶标仪检测TNF-                         脱落，且黏膜和气管周围有大量炎症细胞浸润。与模型
          α、IL-6、IL-4水平。                                     组比较，吴茱萸碱低、高剂量组和地塞米松组大鼠肺组
          2.7 大鼠肺组织中通路及凋亡相关蛋白表达检测                            织上述病理损伤显著改善，且吴茱萸碱高剂量组、地塞
              采用Western blot法检测。取“2.2”项下各组大鼠冻                米松组大鼠肺组织上述病理损伤的改善程度均明显优
          存的肺组织适量，剪碎后，加入 RIPA 裂解缓冲液 1 mL                     于吴茱萸碱低剂量组；而EGF组大鼠肺组织的病理损伤
          提取总蛋白，充分裂解后离心，取上清液，经蛋白定量                           明显加重。与吴茱萸碱高剂量组比较，吴茱萸碱高剂
          后，加入适量 loading buffer，加热变性。取变性蛋白适                  量+EGF 组大鼠肺组织的病理损伤明显加重。结果
          量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后以                           见图1。


          中国药房  2024年第35卷第11期                                              China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 11    · 1353 ·
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