Page 24 - 《中国药房》2024年9期
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鼠灌胃相应剂量双蒸水。实验第 30 天取 1 只模型组小                        2.2.2 马里苷对乙醇诱导的肝细胞损伤的影响
          鼠，采用苏木素-伊红（HE）染色后观察其肝组织病理改                              取对数生长期的细胞，接种于6孔板中（铺板密度为
          变，以肝细胞出现脂滴沉积、脂肪空泡变性为造模成功                            1×10 个/mL）。实验分为正常对照组、模型组、模型+
                                                                   4
          判定标准。                                               1‰DMSO 组和马里苷 3、6、12 μmol/L组，每组设 3 个复
          2.1.2 取材及肝组织中TG、MDA和SOD水平测定                         孔。参考文献[13]方法并进行改良后建立酒精性肝细胞
              末次给药后，小鼠禁食不禁水 12 h，称重。经眼球                       损伤模型：用 0.5% 乙醇、0.01% 硫酸亚铁和 0.1 μmol/L
          取血后，脱颈处死小鼠。取出小鼠肝脏，用冷生理盐水                            油酸刺激大鼠BRL肝细胞24 h致脂质堆积（采用油红O
          冲洗，滤纸吸干后，取大约 0.3 g 肝组织，加 2.7 mL 生理                  染色法观察肝细胞内脂滴的分布，观察到脂滴提示造模
          盐水制成 10% 肝组织匀浆，以 4 000 r/min 离心 10 min；             成功）。马里苷各浓度组在造模同时给予不同浓度的马
          取上清，按照试剂盒说明书操作，测定肝组织中 TG、                           里苷作用 24 h。收集细胞，按照试剂盒说明书操作，测
          MDA和SOD水平。另取部分肝组织置于10%甲醛溶液                          定肝细胞中 TG、MDA 和 SOD 水平，并参照“2.1.4”项下
          中固定，剩余肝组织置于－80 ℃冰箱中保存备用。                            方法测定细胞中 PPARα、CPT-1 和 DGAT 的蛋白表达。
          2.1.3 肝组织病理形态学观察                                    实验重复3次。
              采用HE染色法进行观察。取“2.1.2”项下经10%甲
                                                              2.2.3  MK886 干 预 后 马 里 苷 对 乙 醇 损 伤 肝 细 胞 中
          醛溶液固定的肝组织（每只小鼠取的部位相同），常规操                           PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达的影响
          作制备石蜡切片（厚度4 μm）后行HE染色，在显微镜下
                                                                  为进一步验证马里苷是否通过调控 PPARα 发挥作
          观察肝组织脂肪浸润情况。
                                                              用，采用MK886处理细胞。取对数生长期的细胞，接种
          2.1.4 肝组织中PPARα、CPT-1和DGAT蛋白表达检测
                                                                                        4
                                                              于6孔板中（铺板密度为1×10 个/mL）。实验分为正常
              采用 Western blot 法进行检测。取“2.1.2”项下冻存
                                                              对照组、模型组、模型+MK886组、模型+MK886+马里苷
          的肝组织（每组取3只小鼠样本），采用RIPA裂解液超声
                                                              12 μmol/L 组，每组设 3 个复孔。MK886 的给药浓度参
          提取组织中总蛋白，测定总蛋白浓度后，调整样品体积，
                                                              考文献[14]设定为 10 μmol/L，马里苷给药浓度根据
          使各组上样量保持一致。将蛋白高温变性后，配制10%                          “2.2.2”项下结果设定。正常对照组不处理，模型组按
          分离胶，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电
                                                             “2.2.2”项下方法建立酒精性肝细胞损伤模型，模型+
          压 80 V、电泳时间 20 min，电压 120 V、电泳时间 40
                                                              MK886 组造模的同时加入 MK886，模型+MK886+马里
          min），之后按 90 V、90 min 的转膜条件转移至 NC 膜，用
                                                              苷 12 μmol/L 组造模的同时加入 MK886 和马里苷。培
          5% 脱脂奶粉封闭 90 min；加入 PPARα、CPT-1、DGAT 和
                                                              养24 h后收集各组细胞，按照“2.1.4”项下方法测定细胞
          β-actin 一抗（PPARα 的稀释度为 1∶500，CPT-1 的稀释度
                                                              中PPARα、CPT-1和DGAT的蛋白表达。实验重复3次。
          为1∶300，DGAT和β-actin的稀释度为1∶1 000），4 ℃孵育
                                                              2.3 统计学方法
          过夜。洗膜后，加入对应二抗，室温孵育1 h。ECL 化学
          发光显影，采用 ChemiDoc XRS 凝胶成像系统进行信号                         采用 GraphPad Prism 软件作图和进行数据统计分
          扫描，利用 Image J 软件进行图像分析获取蛋白条带灰                       析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，采用单因素
          度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比                       方差分析和LSD-t法进行组间比较。检验水准α＝0.05。
          值表示目的蛋白的表达水平。                                       3 结果
          2.2 细胞实验                                            3.1 动物实验结果
          2.2.1 马里苷对大鼠BRL肝细胞活力的影响                             3.1.1 马里苷对小鼠肝组织中TG、MDA和SOD水平的
              为筛选马里苷后续实验干预的浓度和时间，采用                           影响
          MTT法测定马里苷对正常BRL肝细胞活力的影响。取                               与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织中TG、MDA
          对数生长期的细胞，接种于 96 孔板中（铺板密度为 1×                        水 平 显 著 升 高（P＜0.01），SOD 水 平 显 著 降 低（P＜
          10 个/mL），置于CO2培养箱内培养 24 h 后，将细胞分为                   0.01）。与模型组比较，马里苷75、150 mg/kg组小鼠肝组
            5
          正常对照组、1‰ 二甲基亚砜（DMSO）组和马里苷 3、6、                      织中 TG、MDA 水平显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），
          12 μmol/L 组（浓度参考文献[9]设置，以 1‰DMSO 为溶                 SOD水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。
          剂进行药液配制），每组设置3个复孔。各组细胞分别经                           表1 各组小鼠肝组织中TG、MDA和SOD水平测定结
          空白培养基、含 1‰DMSO 的培养基、含药培养基处理                              果（x±s，n＝9）
          24 h后，每个细胞培养孔加入20 μL MTT溶液作用4 h，                    组别               TG/（mg/g）  MDA/（nmol/mg prot）  SOD/（U/mg prot）
          吸取上清液，加入100 μL DMSO作用15 min后，利用全                    正常对照组            7.33±2.72  1.72±0.57  220.73±45.13
          波长酶标仪测定490 nm波长下吸光度值，计算细胞相对                         模型组             20.31±3.17 a  2.58±0.28 a  163.49±8.91 a
                                                              马里苷75 mg/kg组    14.95±3.26 b  1.99±0.40 b  178.47±17.12 b
          活力：细胞相对活力＝（实验孔吸光度值－空白孔吸光
                                                              马里苷150 mg/kg组   10.73±1.71 c  1.75±0.39 c  193.30±26.88 c
          度值）/（对照孔吸光度值－空白孔吸光度值）×100%。                            a：与正常对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模
          实验重复3次。                                             型组比较，P＜0.01。


          · 1046 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 9                              中国药房  2024年第35卷第9期
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