Page 26 - 《中国药房》2024年8期
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CDK1 组按照相应转染试剂盒说明书方法分别转染                            亡 相 关 蛋 白（Bax、Bcl-2）、通 路 相 关 蛋 白（CDK1、
          pcDNA-NC 和 pcDNA-CDK1 质粒 48 h，待转染成功（即               CCNB1、PLK1）和内参蛋白（GAPDH）一抗（稀释比例分
          转染效率≥80%）后，再分别使用 80 μmol/L 的 Auc 处理                 别为1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶1 000、1∶900、1∶500、1∶
          48 h。对照组用等体积生理盐水处理48 h。                             500、1∶1 000、1∶30 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加
          2.1.3 细胞增殖与细胞克隆形成能力检测                               入相应二抗（稀释比例为 1∶10 000），于室温下孵育 2 h；
              取对数生长期的MCF-7细胞，按照“2.1.2”项下方法                    经 ECL 显色后，使用凝胶成像系统成像。使用 Image J
          分组、处理 48 h 后，再按照 EdU 细胞增殖试剂盒说明书                     软件进行蛋白条带灰度值分析，以目的蛋白与内参蛋白
          方法操作，以 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核后，                    的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
          使用荧光显微镜观察并记录细胞总数及 EdU 阳性细胞
                                                              2.2 裸鼠移植瘤实验
         （呈绿色）数，并按下式计算细胞增殖率：增殖率＝EdU
                                                                  将裸鼠适应性喂养 7 d 后，于其左侧乳腺区域皮下
          阳性细胞数/细胞总数×100%。
                                                              注射 5×10 个/mL 的 MCF-7 细胞悬液 0.2 mL 以建立乳
                                                                       7
              取对数生长期的MCF-7细胞，按照“2.1.2”项下方法
                                                                                                          3
                                                              腺癌移植瘤模型。待肿瘤体积增加到 50～100 mm 时，
          分组、处理10 d后，收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤2次
                                                              将裸鼠随机分为对照组和Auc组，每组12只。Auc组裸
          后，用甲醇 700 μL 固定 15 min；干燥后，用 0.1% 结晶紫
                                                              鼠灌胃 100 mg/（kg·d）的 Auc（以生理盐水为溶剂，浓度
          染色液染色 30 min；吸弃染色液，细胞用水洗涤并风干                                    [4]
          30 s，使用显微镜观察细胞克隆形成情况并记录细胞克                          参考相关文献 设置），对照组裸鼠灌胃等体积生理盐
                                                              水，每天1次，连续15 d。实验过程中，每5 d测定裸鼠肿
          隆形成数（细胞数＞50为有效克隆）。
          2.1.4 细胞侵袭与迁移能力检测                                   瘤体积 1 次；15 d 后将其处死，取出瘤体，测定体积并称
              取对数生长期的 MCF-7 细胞，用不含血清的 RPMI                    重，随后按“2.1.6”项下方法检测肿瘤组织中 CDK1、
                                4
          1640 培养基重悬至 1×10 个/mL，取该细胞悬液 200 μL                 CCNB1、PLK1蛋白的表达水平。
          置于 Transwell 上室，同时将含 10% 胎牛血清的 RPMI                 2.3 统计学方法
          1640 培养基 500 μL 置于 Transwell 下室，培养 24 h。将               使用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。数据以
          上室细胞按照“2.1.2”项下方法分组、处理 48 h 后，去除                    x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          上室底部未穿膜的细胞，将穿膜细胞（即侵袭细胞）用                            比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          4%多聚甲醛固定，并用结晶紫染色液染色，在显微镜下                           3 结果
          观察细胞侵袭情况并记录侵袭细胞数（每个样本随机选                            3.1 细胞实验结果
          取5个视野，以其平均值作为检测结果）。                                 3.1.1 Auc干预浓度及时间的筛选结果
                                               5
              取对数生长期的MCF-7细胞，以4×10 个/mL、每孔                        培养 24、48、72 h 后，与对照组相比，10 μmol/L 的
          300 μL 接种于 6 孔板中，待细胞铺满后，用移液器枪头                      Auc虽能降低细胞活力，但组间比较差异无统计学意义
          在板内垂直划线。将细胞按照“2.1.2”项下方法分组、处                       （P＞0.05），而 20、40、80、160 μmol/L 的 Auc 均能显著降
          理，分别于处理0、24 h时使用显微镜观察并测量各组细                         低细胞活力，且有一定的时间依赖性（P＜0.05）。结果
          胞的划痕宽度，并按下式计算划痕愈合率：划痕愈合
                                                              略。因 10 μmol/L 的 Auc 对细胞活力的抑制作用不明
          率＝（0 h 时的划痕宽度－24 h 时的划痕宽度）/0 h 时的                   显，160 μmol/L 的 Auc 作用不同时长以及 20、40、80
          划痕宽度×100%。
                                                              μmol/L 的 AUC 作用 72 h 对细胞活力的影响较为明显，
          2.1.5 细胞凋亡及周期检测
                                                              故经综合考虑，后续实验以 20、40、80 μmol/L 作为 Auc
              取对数生长期的MCF-7细胞，按照“2.1.2”项下方法
          分组、处理 48 h。收集细胞，加入 Annexin Ⅴ-FITC 和 PI              的干预浓度，48 h作为其干预时间。
                                                              3.1.2 Auc对MCF-7细胞增殖与克隆形成的影响
          试剂各 5 μL，于室温下避光孵育 15 min，使用流式细胞
                                                                  与对照组相比，Auc 各浓度组细胞的增殖率和克隆
          仪进行细胞凋亡检测。
                                                              形成数均显著降低，且有一定的浓度依赖性（P＜0.05）；与
              取对数生长期的MCF-7细胞，按照“2.1.2”项下方法
          分组、处理48 h。收集细胞，加入核糖核酸酶100 μL，于                      Auc-H+pcDNA-NC组相比，Auc-H组细胞上述指标的差
          37 ℃下孵育30 min；加入PI试剂400 μL，于4 ℃下避光孵                 异均无统计学意义（P＞0.05），而Auc-H+pcDNA-CDK1组
          育30 min，使用流式细胞仪进行细胞周期检测。                            则显著升高（P＜0.05）。结果见图1、图2。
          2.1.6 细胞相关蛋白表达检测                                    3.1.3 Auc对MCF-7细胞侵袭与迁移能力的影响
              取对数生长期的MCF-7细胞，按照“2.1.2”项下方法                        与对照组相比，Auc 各浓度组的细胞侵袭数和划痕
          分组、处理 48 h。收集细胞，裂解后收集上清液。取上                         愈合率均显著降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05）；与Auc-
          清液经蛋白定量、变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯                           H+pcDNA-NC组相比，Auc-H组细胞上述指标的差异均
          酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上。洗膜                             无统计学意义（P＞0.05），而 Auc-H+pcDNA-CDK1 组则
          后，加入EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、FN）、凋             显著升高（P＜0.05）。结果见图3、图4。


          · 920 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 8                               中国药房  2024年第35卷第8期
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