Page 60 - 《中国药房》2024年4期
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1磨牙牙颈部，于牙龈上缝2针固定，在其牙龈处涂抹麦                           2.5 大鼠牙龈组织中SOD、CAT、ROS水平的检测
          芽糖，每天3次，并以20%蔗糖溶液及软食喂养；7 d后，                            取“2.3”项下冻存的各组大鼠牙龈组织蛋白样品液
          观察大鼠牙龈，若出现龈缘红肿、光亮、松软，触碰易出                           适量，于4 ℃下融化后，取适量，采用ELISA法以酶标仪
          血，并伴有明显的牙龈组织病理改变（随机取4只造模大                           测定其中SOD、CAT、ROS水平（具体操作按照相应试剂

          鼠处死后观察），则视为牙龈炎大鼠模型复制成功。将                            盒说明书进行）。
          造模成功的 48 只大鼠随机分为模型组、原花青素组、                          2.6 大鼠牙龈组织中PI3K/Akt/VEGF信号通路相关蛋
          740Y-P 组、原花青素+740Y-P 组，每组 12 只；另选 12 只              白表达的检测
          大鼠，不作任何处理并正常喂养，作为对照组。                                   取“2.3”项下冻存的各组大鼠剩余的牙龈组织蛋白
                                                   [9]
              原花青素组大鼠灌胃160 mg/kg的原花青素 （将原
                                                              样品液，煮沸5 min使变性；取变性蛋白适量，于120 V电
          花青素以生理盐水溶解制成质量浓度为16 mg/mL的混
                                                              压下电泳 70 min，再以湿转法（110 V，90 min）转移到硝
          悬液，灌胃体积为 10 mL/kg，下同）；740Y-P 组大鼠腹腔
                                                              酸纤维素膜上，以 5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h；加入 p-
                                 [10]
          注射 0.02 mg/kg 的 740Y-P （740Y-P 以生理盐水溶解
                                                              PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、VEGF、GAPDH（内参）一抗（稀
          制成质量浓度为 0.002 mg/mL 的溶液，注射体积为 10
                                                              释度均为 1∶2 500），于 4 ℃下孵育 12 h；以 TBST 缓冲
          mL/kg，下同）；原花青素+740Y-P 组大鼠灌胃 160 mg/kg
                                                              液洗涤5 min×3次，加入相应二抗（稀释度为1∶2 700），
          的原花青素，同时腹腔注射 0.02 mg/kg 的 740Y-P；对照
                                                              于室温下孵育 2 h；以 TBST 缓冲液洗涤 5 min×3 次，
          组和模型组大鼠灌胃 10 mL/kg 生理盐水；每天 1 次，持
                                                              用 ECL 显色后，于凝胶成像仪下成像。运用 Image J
          续7 d。
                                                              软 件 定 量 分 析 各 蛋 白 的 条 带 灰 度 值 ，并 以 此 计 算
          2.2 大鼠牙龈指数的测定
                                                              VEGF 蛋白的表达水平（VEGF/GAPDH）和 PI3K、Akt
              末次给药结束24 h后，各组大鼠经麻醉后使用钝头
                                                              蛋白的磷酸化水平（p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt）。
          探针探诊牙龈，参照以下标准测定牙龈指数：牙龈正常，
                                                              2.7 统计学方法
          记0分；牙龈有轻度炎症和轻度水肿，颜色有轻度改变，
                                                                  应用 SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析。计量
          探诊不出血，记1分；牙龈有中度炎症，水肿光亮、色红，
                                                              资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，
          探诊出血，记2分；牙龈有重度炎症，有自动出血倾向，可
          见明显红肿或溃疡，记3分           [11―12] 。                    进 一 步 两 组 间 比 较 采 用 SNK-q 检 验 。 检 验 水 准
          2.3 大鼠龈沟液中 IL-18、iNOS、ALP 水平的检测及标                   α＝0.05。
          本的采集                                                3 结果
              取2 mm×4 mm的滤纸条，插入大鼠两下门齿龈沟                       3.1 原花青素对牙龈炎大鼠牙龈指数的影响
          内，60 s后取出并浸入生理盐水0.5 mL中，振荡60 s后，                        与对照组比较，模型组大鼠牙龈指数显著升高（P＜
          取出滤纸，使用 ELISA 法以酶标仪测定其中 IL-18、                      0.05）；与模型组比较，原花青素组大鼠牙龈指数显著降
          iNOS、ALP 水平（具体操作严格按照相应试剂盒说明书                        低（P＜0.05），740Y-P 组大鼠牙龈指数显著升高（P＜
          进行）。                                                0.05）；与原花青素组比较，原花青素+740Y-P 组大鼠牙
              随后，各组大鼠经麻醉后断头处死，取其牙龈组                           龈指数显著升高（P＜0.05）；与 740Y-P 组比较，原花青
          织适量，转移至高效 RIPA 裂解液中，匀浆，于 4 ℃下以                      素+740Y-P 组大鼠牙龈指数显著降低（P＜0.05）。结果
          3 500 r/min 离心 10 min，取上层蛋白样品液，采用 BCA               见表1。
          法检测蛋白浓度后，于－80 ℃下保存，备用；取大鼠剩余
                                                              表1 各组大鼠牙龈指数和龈沟液中IL-18、iNOS、ALP
          的牙龈组织，经水漂洗后，依次浸入80%～100%的乙醇                              水平比较（x±s，n＝12）

          中脱水，以二甲苯透明后，行常规石蜡包埋、切片（厚度
                                                              组别         牙龈指数/分   IL-18/（pg/mL）  iNOS/（U/mL）  ALP/（U/L）
          约4 μm），备用。                                          对照组           0      53.15±10.36  12.85±2.54  231.27±25.08
          2.4 大鼠牙龈组织病理形态的观察                                   模型组         2.02±0.17 a  135.42±18.17 a  60.13±9.16 a  418.39±48.43 a
                                                              原花青素组       0.42±0.07 b  67.98±9.30 b  24.79±4.39 b  325.13±45.82 b
              取“2.3”项下各组大鼠的牙龈组织切片，经二甲苯脱
                                                              740Y-P组     2.61±0.15 b  218.64±40.85 b  118.92±17.08 b  562.91±66.25 b
          蜡、乙醇水化后，进行 HE 染色（具体操作按照相应试剂                         原花青素+740Y-P组  1.95±0.12 cd  130.12±21.05 cd  57.34±7.93 cd  405.76±52.59 cd
          盒说明书进行），经脱水、透明后封片，使用显微镜观察                              a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与原花青
          其牙龈组织的病理形态，并任选5个视野拍照。                               素组比较，P＜0.05；d：与740Y-P组比较，P＜0.05。


          · 438 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 4                               中国药房  2024年第35卷第4期
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