Page 38 - 《中国药房》2024年4期
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膏各 0.2 g 置于供给池中并确保乳膏和各组皮肤充分接                        2.5 川芎挥发油配伍雷公藤甲素对HaCat细胞毒性的
          触（每组平行6份），分别于4、6、8、10、12、24 h时抽取接                   影响
          收液1 mL，并补充同体积同温度的空白接收液。将取出                          2.5.1 细胞培养
          的接收液按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，再按                              用含 10% 胎牛血清和含青霉素、链霉素的 DMEM
         “2.2.2”项下色谱条件进样测定，并按照如下公式计算各                         高糖培养基在 37 ℃含 5%CO2的培养箱中培养，待细胞
          时 间 点 的 单 位 面 积 累 计 透 皮 量（Qn ）：Qn＝                  生长至状态稳定后，取对数生长期、生长状态稳定的细
                n - 1                                         胞进行后续实验。
         （VC + ∑ C V）/A，式中，A 为扩散池的有效扩散面积，V                    2.5.2 细胞毒性实验
                      i
              n
                    i
                 i = 1
          为接收液总体积，Cn为第 n 次取样时接收液中的药物浓                             细胞毒性采用CCK-8法进行检测。
          度，Ci为第i次取样时接收液中的药物浓度，V i为第i次取                          （1）川芎挥发油和雷公藤甲素对 HaCat 细胞毒性的
                                                              影响：取生长状态稳定的对数生长期HaCat细胞，制备成
          样体积。以 Qn对时间（t）作线性回归，所得斜率即为雷
                                                                         4
                                                              密度为9×10 个/mL的悬液，以S型接种于96孔板中，每
          公藤甲素的透皮吸收速率（Jss）。分别采用零级动力
                                                              孔200 μL，待细胞融合至80%～90%，弃去完全培养液，
          学、一级动力学、Higuchi 方程对释放过程进行拟合，并
                                                              用不含钙镁的Hanks’平衡盐溶液清洗2遍，根据课题组
          计算决定系数（R ）。采用 Graph Pad Prism 5.0 和 SPSS
                          2
                                                              前期实验和预实验结果，分别用质量浓度为 10、18、20、
          22.0 软件进行数据分析，计量数据以 x±s 表示；多组间
                                                              36、72、144、272、544 ng/mL的雷公藤甲素和1.155、5.75、
          比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较时采用
                                                              11.55、115.5、1 150 μg/mL 的川芎挥发油溶液处理细胞
          LSD-t检验，检验水准α＝0.05。
                                                              24 h，每个浓度设置6个复孔，另设不加药物但加细胞的
              结果显示，24 h 内雷公藤甲素组和配伍 1∶10、配伍
                                                              对照组和不加药物、不加细胞的空白组。处理 24 h 后，
          1∶50、配伍 1∶100 组雷公藤甲素的 Qn 分别为（21.98±
                                                              吸去 96 孔板中的药物，用不含钙镁的 Hanks’平衡盐溶
          0.13）、（26.87±0.36）、（31.46±1.08）、（18.51±1.95）μg/cm 2  液清洗，加入含10%CCK-8的基础培养基溶液，每孔100
                                                     2
         （n＝6），Jss分别为1.058、1.171、2.950、0.748/[μg/（cm·h）]。     μL，将细胞置培养箱中孵育2 h后，置于酶标仪中检测其
          与雷公藤甲素组比较，配伍 1∶10 组和配伍 1∶50 组 24 h                  在 450 nm 波长处的光密度（OD）值，并按公式计算细胞
          内雷公藤甲素的Qn （P＜0.01）和Jss有所升高；配伍1∶100                  存活率：细胞存活率＝（ 给药组OD值－空白组OD值 ）/
          组的 Qn （P＜0.05）和 Jss有所下降。各组雷公藤甲素的                   （ 对照组OD值－空白组OD值 ）×100%。结果显示，当雷
          24 h累计渗透曲线见图2。以Q24 h对t进行拟合，结果显                      公藤甲素质量浓度为20 ng/mL时、川芎挥发油质量浓度
          示雷公藤甲素组的体外透皮释放过程符合零级方程和                             为11.55 μg/mL时，细胞存活率均大于90%，说明该浓度
          Higuchi 方程，配伍 1∶10 组和配伍 1∶100 组的体外透皮                下二者单独给药均不会对HaCat细胞产生毒副作用，但
          释放过程更符合一级动力方程，而配伍1∶50组中雷公藤                          随着给药浓度增大，HaCat细胞的存活率逐渐降低，结果
          甲素的体外透皮释放过程则更符合Higuchi方程。拟合                         见图3。
          结果见表2。                                               120                         120
                                                               100                         100
                    40    雷公藤甲素组                                80                         80
                          配伍1∶10组                              细胞存活率/%  60                细胞存活率/%  60
                    30    配伍1∶50组                               40                         40
                   ]
                   （ cm 2 · h ）  配伍1∶100组                       20 0                       20 0
                   （ μg/  20                                       10         18                   20                36      72             144         272          544  1.155    5.75      11.55   115.5  1 150
                   Q n /[                                               质量浓度/（ng/mL）            质量浓度/（μg/mL）
                    10                                                A.雷公藤甲素细胞毒性             B.川芎挥发油细胞毒性
                                                              图3 雷公藤甲素和川芎挥发油对HaCat细胞毒性的影响
                    0                                            （2）川芎挥发油和雷公藤甲素配伍对 HaCat 细胞毒
                      0          4           8         12        16         20        24         28
                                  时间/h                        性的影响：按“2.5.2”（1）项下方法铺板及培养细胞，再以
                图2 各组雷公藤甲素24 h累计渗透曲线                          雷公藤甲素质量浓度为 18、36、72、144 ng/mL 分别配伍
            表2 各组经皮渗透实验数据拟合结果（x±s，n＝6）                        川芎挥发油1∶10、1∶50、1∶100处理细胞并测定OD值后
                      零级方程          一级方程         Higuchi 方程   计算细胞存活率。结果，与雷公藤甲素组比较，雷公藤
           组别
                    拟合方程    R  2  拟合方程    R  2  拟合方程   R  2   甲素质量浓度在36、72、144 ng/mL时，配伍1∶10组和配
           雷公藤甲素组  Q＝1.06t－2.94  0.992 Q＝65.32（1－e －0.015t ）  0.911 Q＝7.47t －15.08 0.992  伍 1∶50 组可以显著提高 HaCat 细胞的存活率（P＜0.05
                                                 1/2
                                                 1/2
           配伍1∶10组  Q＝1.17t－1.04  0.992 Q＝84.66（1－e －0.015t ）  0.997 Q＝8.25t －14.40 0.984
                                                 1/2
           配伍1∶50组  Q＝2.95t＋1.24  0.945 Q＝56.40（1－e －0.034t ）  0.982 Q＝8.94t －11.83 0.991  或P＜0.01），而配伍1∶100组细胞的存活率反而降低，但
           配伍1∶100组  Q＝0.75t＋0.02  0.996 Q＝269.92（1－e －0.003t ） 0.997 Q＝5.27t －8.51  0.988  差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图4。
                                                 1/2
          · 416 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 4                               中国药房  2024年第35卷第4期
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