Page 43 - 《中国药房》2024年4期
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2.2 一般情况观察及疾病活动指数计算                                酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用 2           －ΔΔCt 法计算目的基因
              实验期间，于每天给药前称定并记录各组小鼠体                          mRNA 的表达水平。各目的基因 PCR 扩增的引物序列
          重，观察其粪便排泄情况。于末次给药后、采样前，参照                          和产物长度见表2。
                      [6]
          相关文献方法 计算各组大鼠的疾病活动指数（disease                         表2 各目的基因PCR扩增的引物序列和产物长度
          activity index，DAI），DAI＝（体重减少比例评分+粪便出               目的基因               引物序列               产物长度/bp
                                                              IL-17     上游：5′-TGATGCTGTTGCTGCTGCTGAG-3′  75
          血评分+粪便硬度评分）/3。各项具体评分标准如表1所
                                                                        下游：5′-GACACGCTGAGCTTTGAGGGATG-3′
                                            [6]
          示，DAI评分＞0.5表明UC模型复制成功 。                             IL-10     上游：5′-GGACAACATACTGCTAACCGACTC-3′  81
                         表1 DAI评分标准                                     下游：5′-TGGATCATTTCCGATAAGGCTTGG-3′
                                                              TNF-α     上游：5′-CCACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3′  118
          评分       体重减少比例            粪便出血         粪便硬度
                                                                        下游：5′-TGGTTTGTGAGTGTGAGGGTCTG-3′
          0          无减少              未出血         正常粪便        IL-1β     上游：5′-CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3′  145
          1          1%～4%           略微带血         轻微稀便                  下游：5′-TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC-3′
          2          5%～9%           较少带血          稀便
                                                              IL-6      上游：5′-CTTCTTGGGACTGATGCTGGTGAC-3′  91
          3         10%～20%          较多带血         水样稀便                  下游：5′-TCTGTTGGGAGTGGTATCCTCTGTG-3′
          4         20%以上            大量带血         严重拉稀
                                                             2.7 结肠组织中炎症相关蛋白表达水平检测
          2.3 样本采集
              末次给药后，各组小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（50                           采用Western blot法检测。取“2.3”项下冻存的正常
          mg/kg）进行麻醉，于眼眶取血，血样在室温下放置 1 h                      组、模型组、KSC-F50 组、KSC-F100 组小鼠结肠组织各
          后，在 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 15 min，分离上层血清，            适量，加入 RIPA 裂解液，于 4 ℃下研磨后，再于冰上放
          备用。取血后，各组小鼠以颈椎脱位法处死，打开腹腔，                          置 30 min，以 3 500 r/min 离心 15 min，收集上清液，以
          完整取出其结肠组织，测量结肠长度后，部分结肠组织                           BCA法定量后作变性处理。取变性后的蛋白样品适量，
          用4%多聚甲醛溶液固定，用于病理形态观察；另一部分                          经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至
          结肠组织于－80 ℃下保存，用于后续指标检测。                            PVDF 膜上，以 5% 脱脂奶粉封闭；洗膜后，加入 IL-1β、
          2.4 结肠组织病理形态观察                                     FOXO1、PI3K、p-PI3K、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p-Akt、
              取“2.3”项下固定的各组小鼠结肠组织适量，经乙醇                      β-actin 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），于 4 ℃下孵育过
          逐级脱水、二甲苯透明后，行常规石蜡包埋、切片。切片                          夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例为 1∶5 000），室温
          烘干后行脱蜡及乙醇脱水处理，再依次用苏木精、伊红                           孵育 2 h；洗膜 3 次，利用化学发光酶标底物显色后，置
          染液染色，经二甲苯透明后，以中性树胶封片，使用光学                          于化学发光成像系统下成像。以 β-actin 为内参，使用
          显微镜进行病理形态观察及图像采集。                                  Image J软件分析各目的蛋白的条带灰度值，以目的蛋白
          2.5 血清及结肠组织中炎症因子水平检测                               与内参的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
              取“2.3”项下各组小鼠血清样品适量，按相应试剂盒                      2.8 统计学方法
          说明书方法操作，以酶标仪检测血清中 IL-1β、IL-6、IL-                       采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。数据均
          8、IL-10、TNF-α 水平。取“2.3”项下各组小鼠冻存的结                  以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步
          肠组织适量，加入磷酸盐缓冲液（pH7.4），匀浆，于 4 ℃                     两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          下以12 000 r/min离心15 min，收集上清液，以BCA法定                3 结果
          量后，按相应试剂盒说明书方法操作，以酶标仪检测结                           3.1 KSC-F 对 UC 小鼠一般情况及结肠组织病理形态

          肠组织中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α水平。           的影响
          2.6 结肠组织中炎症因子mRNA表达水平检测                                在饮用DSS水溶液后，模型组小鼠的体重整体呈下
              采用 RT-PCR 法检测。取“2.3”项下冻存的正常组、                  降趋势，DAI 评分较正常组显著升高（P＜0.01）且超过
          模型组、KSC-F50 组、KSC-F100 组小鼠结肠组织各适                   0.5；结肠较正常组显著缩短（P＜0.01），结肠组织的隐窝
          量，利用Trizol试剂提取其总RNA并逆转录为cDNA，再                     结构大量受损，杯状细胞明显减少，炎症细胞浸润严重。
          以所得 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。总反应体积为 20                    经药物干预后，各药物组小鼠体重减轻的情况有所改
          μL，包括 SYBR Premix Ex TaqⅡ（9 μL）、上游引物（0.3           善，DAI评分均较模型组显著降低（P＜0.01）；同时，小鼠
          μL）、下游引物（0.3 μL）、cDNA 模板（2 μL）和 ddH2O              结肠均较模型组显著延长（P＜0.01），结肠组织的隐窝
         （8.4 μL）。反应条件如下：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性                 结构形态得到明显改善，且可见大量杯状细胞，炎症细
          5 s，62 ℃退火和延伸20 s，共40个循环。以甘油醛-3-磷                  胞浸润情况亦有所减轻。结果见图2。


          中国药房  2024年第35卷第4期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 4    · 421 ·
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