Page 19 - 《中国药房》2024年4期
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2.2 小鼠FBG和24 h尿蛋白水平检测                              液室温封闭2 h；加入RAGE、COL-Ⅳ、iNOS、β-actin一抗
              分别在给药后第 0、4、8 周，禁食 12 h 后采集各组小                （稀释度1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；用PBST缓冲液清
          鼠尾静脉血适量，使用血糖仪检测其 FBG；通过代谢笼                         洗3次，加入相应二抗（稀释度1∶2 000），室温孵育2 h；以
          收集其24 h尿液，离心，取上清液，参照尿蛋白试剂盒说                        ECL发光液显色后，置于凝胶成像仪下成像。以β-actin
          明书方法以酶标仪检测其24 h尿蛋白水平。                              为内参，利用Image J软件分析各目标蛋白的表达量。
          2.3 小鼠血清中IL-12、IL-10、BUN、Scr水平检测                   2.8 统计学方法
              在给药后第8周，于小鼠眼眶取血，静置0.5 h后，以                         采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。数据以
          3 000 r/min离心15 min，分离上层血清，参照相应试剂盒                 x±s 表示，多组间采用单因素方差分析，进一步两两比
          说明书方法以酶标仪检测小鼠血清中炎症因子（IL-12、                        较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          IL-10）和肾功能指标（BUN、Scr）水平。                           3 结果
          2.4 小鼠肾脏病理损伤形态学和纤维化水平观察                            3.1 山茱萸新苷对 DN 模型小鼠 FBG 和 24 h 尿蛋白水
              于眼眶取血后，脱颈椎处死各组小鼠，分离肾脏并                         平的影响
          横切左侧肾皮质适量，置于10%中性福尔马林固定液中                              与正常组比较，模型组小鼠给药后第 0、4、8 周的
          固定，脱水，用石蜡常规包埋后切片，分别进行苏木精-                          FBG和24 h尿蛋白水平均显著升高（P＜0.01）。与模型
                                                             组小鼠比较，各药物组小鼠给药后第 4、8 周的 FBG（氨
          伊红（HE）、Masson染色，置于显微镜下观察其肾皮质的
                                                             基胍组给药后第4周除外）、24 h尿蛋白均显著下降（P＜
          病理损伤和纤维化改变。
                                                             0.05或P＜0.01）。结果见表1。
          2.5 小鼠肾小球微观结构观察
                                                             表1 山茱萸新苷对DN模型小鼠FBG和24 h尿蛋白水
              采用透射电镜进行观察。取各组小鼠左侧肾皮质
                                                                  平的影响（x±s，n＝6）
          适量，在 2.5%Gluta 固定液中固定，分别用 50%、70%、
                                                                           FBG/（mmol/L）        24 h尿蛋白/mg
          80%、90%、100% 丙酮梯度脱水，用环氧树脂包埋后切                       组别     给药后第0周 给药后第4周 给药后第8周 给药后第0周 给药后第4周 给药后第8周
          片，再进行枸橼酸铅-醋酸铀染色，置于透射电镜下观察                           正常组     5.5±0.5  5.3±0.7  5.0±0.8  0.06±0.08  0.11±0.15  0.06±0.11
                                                              模型组    18.1±3.8 a  19.9±3.4 a  21.1±6.7 a  1.37±0.04 a  1.52±0.42 a  1.23±0.23 a
          其肾小球微观结构。
                                                              氨基胍组   17.1±3.9  21.0±4.0  13.6±5.2 b  1.19±0.10  1.05±0.28 b  0.54±0.14 c
          2.6 小鼠肾皮质中RAGE蛋白阳性表达检测                              山茱萸新苷组 17.9±4.7  16.9±4.1 b  10.9±3.5 c  1.30±0.06  1.16±0.16 b  0.36±0.11 c
              采用免疫组化法进行检测。取“2.4”项下各组小鼠                          a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组
          的肾皮质切片，置于二甲苯中固定20 min×2次以脱蜡，                       比较，P＜0.01。
                                                             3.2 山茱萸新苷对 DN 模型小鼠血清中 IL-12、IL-10、
          再依次用无水乙醇、95% 乙醇、85% 乙醇、70% 乙醇脱
                                                             BUN、Scr水平的影响
          水，每次 5 min；用水冲洗，采用柠檬酸钠缓冲液进行抗
                                                                 与正常组比较，模型组小鼠血清促炎因子 IL-12、
          原修复；用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 5 min×3 次，用 3%
                                                             BUN、Scr 水平均显著升高，抗炎因子 IL-10 水平显著降
          过氧化氢溶液覆盖切片 20 min 进行内源性过氧化物酶
                                                             低（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组小鼠血清 IL-12、
          灭活，再以牛血清白蛋白室温封闭1 h；加入RAGE一抗
                                                             BUN、Scr 水平均显著降低，IL-10 水平均显著升高（P＜
         （稀释度 1∶100），于 4 ℃下孵育过夜；用 PBS 清洗 2
                                                             0.01）。结果见表2。
          min×3次，加入相应二抗（稀释度1∶100），于室温下孵育
                                                             表2 山茱萸新苷对 DN 模型小鼠血清中 IL-12、IL-10、
          1 h；用PBS清洗5 min×3次，加入DAB显色；用水冲洗，
                                                                  BUN、Scr水平的影响（x±s，n＝6）
          苏木精复染 2 min；用水冲洗，经乙醇脱水、二甲苯透明
                                                              组别      IL-12/（pg/mL）  IL-10/（pg/mL）  BUN/（mmol/L）  Scr/（μmol/L）
          后，使用中性树脂封片，置于显微镜下观察 RAGE 蛋白                         正常组      42.84±1.54  290.15±24.16  13.59±2.19  17.42±5.81
          阳性表达（呈棕黄色）情况，利用 Image J 软件对其荧光                      模型组      57.31±7.39 a  233.79±10.93 a  28.81±2.45 a  65.61±14.91 a
                                                              氨基胍组     46.47±3.82 b  290.15±11.62 b  20.32±1.51 b  41.03±11.68 b
          强度进行定量分析。
                                                              山茱萸新苷组   44.08±2.45 b  285.30±12.42 b  17.45±1.39 b  48.20±6.64 b
          2.7 小鼠肾皮质中RAGE、COL-Ⅳ、iNOS蛋白表达检测                       a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01。
              采用 Western blot 法进行检测。在冰上剪取各组小                 3.3 山茱萸新苷对 DN 模型小鼠肾皮质病理损伤和纤
          鼠的肾皮质适量，置于 10 mL 离心管中，加入裂解液 1                      维化改变的影响
          mL，匀浆裂解多次后，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10                  与正常组比较，模型组小鼠肾皮质中肾小球系膜基
          min，收集上清液，以 BCA 法进行定量；将上清液与 5×                     质明显增厚并出现空泡变性，部分间质区域可见明显的
          蛋白上样缓冲液以体积比4∶1混合后，于95 ℃煮沸变性                        炎症细胞浸润。与模型组比较，各药物组小鼠肾皮质中
          5 min；取变性蛋白适量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转                        肾小球结构较为完整，肾小球系膜基质增生程度减轻，
          移至聚偏二氟乙烯膜上，以含 5% 牛血清白蛋白的封闭                         间质内炎症细胞浸润有所减少。结果见图1。


          中国药房  2024年第35卷第4期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 4    · 397 ·
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