Page 24 - 《中国药房》2024年4期

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近年来IHD的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势 。正常 剂盒（批号分别为C0201、C0222、C2009S、S0033）均购自
心肌细胞中，线粒体可通过提供腺苷三磷酸（adenosine 上海碧云天生物技术股份有限公司；肌酸激酶（creatine
triphosphate，ATP）维持心肌细胞活力和功能，而心肌缺 kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、
血会严重影响线粒体的结构和功能，致使 ATP 供应不 丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（批号分别
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足，从而影响心肌功能 ；阻塞的冠状动脉再灌注还可进 为 A032-1-1、A020-2-2、A003-1-1）均购自南京建成生物
一步导致线粒体相关的氧化损伤、细胞死亡和炎症反 科技有限公司；肌酸激酶同工酶 MB（creatine kinase
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应 。因此，研究心肌缺血后线粒体的能量代谢对于 isoenzyme-MB，CK-MB）、大鼠线粒体呼吸链复合物Ⅰ
IHD治疗药物的研发至关重要。 （complex Ⅰ）和complex Ⅳ均购自江苏晶美生物科技有
药用植物被认为是天然的小分子库和新药发现的 限公司。
重要资源。槲皮素作为天然的植物化合物，在植物界分 1.3 细胞与动物
布广泛，主要存在于苹果、浆果、洋葱、芦笋等水果和蔬 大鼠 H9c2 心肌细胞购自中国科学院上海细胞库。
菜中，由于其具有强大的抗氧化活性，引起了植物医学 48只SPF级的健康SD雄性大鼠购自北京华阜康生物科
和中药研究学者的广泛关注。槲皮素是类黄酮家族成 技股份有限公司，生产许可证号为 SCXK（京）2019-
员之一，具有显著的心脏益处，研究表明其可能通过降 0028。动物实验根据青海省西宁市实验动物伦理委员
低血压、抗氧化、干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统和改 会批准的标准进行操作。
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善内皮依赖性患者的血管功能来改善心血管疾病 。基 2 方法
于此，本研究通过构建 H9c2 心肌细胞缺氧模型和大鼠 2.1 细胞实验
急性心肌缺血模型探讨了槲皮素对心肌缺血后心肌细 2.1.1 H9c2心肌细胞的培养

胞线粒体代谢功能的影响，以期为治疗IHD提供参考。 将H9c2心肌细胞置于含1% 青霉素-链霉素双抗和
1 材料 10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在5%CO2、饱和
1.1 主要仪器 湿度、37 ℃的条件下培养。
本研究所用主要仪器包括CytoFLEX型流式细胞仪 2.1.2 细胞分组、造模与给药
（美国Beckman Coulter公司）、XB120A型电子分析天平 按前期实验结果设置给药剂量。实验分为空白组、
（瑞士 Precisa 公司）、ELX800 型酶联免疫检测仪（美国 模型组、阳性对照组和槲皮素高、中、低剂量组，每组3个
Bio-Tek 公司）、ECLIPSE Ti-s 型荧光倒置显微镜（日本 复孔。空白组细胞不做任何处理，正常培养2 h；模型组
Nikon公司）、TG16-WS型高速台式离心机（长沙湘仪离 细胞重悬后，接种于24孔板中，待细胞融合度为80%时
心机仪器公司）、TDL-50B型低速台式离心机（上海安亭 置于复合成分缓冲液（20 mmol/L 2-脱氧-D-葡萄糖、0.9
科学仪器有限公司）、MCO-15AC-SC 型 CO2培养箱（日 mmol/L CaCl2、12 mmol/L KCl、20 mmol/L 羟乙基哌嗪乙
本Sanyo公司）。 硫磺酸、137 mmol/L NaCl、0.5 mmol/L MgCl2，pH 6.2）
1.2 主要药品与试剂 中，并于含 95%N2、0.1%O2、5%CO2、37 ℃的条件下放置
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环孢菌素 A（批号 C106893，纯度 98%）、槲皮素（批 1 h诱导缺氧 ；阳性对照组细胞造模前加入1 μmol/L的
号BD105676，纯度99%）均购自河南奥科标准物质科技 环孢菌素A预处理1 h，再缺氧处理1 h；槲皮素高、中、低
有限公司；盐酸曲美他嗪（批号22329-76-6，纯度97%）购 剂量组细胞先用40、20、10 μmol/L的槲皮素预处理1 h，
自上海麦克林生化科技股份有限公司；ATP检测试剂盒 再缺氧处理 1 h。结束后，收集各组细胞及其上清液用
（批号ml059183）购自上海酶联生物科技有限公司；磷酸 于后续检测。

盐缓冲液（批号B040100）购自北京中杉金桥生物技术有 2.1.3 H9c2心肌细胞中ROS的检测
限公司；DMEM高糖培养基（批号11995-065）、胎牛血清 使用胰酶消化细胞，将细胞悬液移至离心管中，以
（批号10099-141）均购自美国Gibco公司；线粒体膜电位 1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入DMEM完全培养
（mitochondrial membrane potential，MMP）检测试剂盒 基，将细胞吹打均匀后计算细胞悬液的密度。将细胞密
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（批号 40706ES60）购自上海翊圣生物科技有限公司；胰 度达 5×10 个/mL 左右的细胞悬液接种至 6 孔板中，于
蛋白酶、青霉素-链霉素溶液（100×）、线粒体膜通透性 37 ℃培养箱中培养。将细胞按照“2.1.2”项下方法分组
转 换 孔（mitochondrial permeability transition pore， 处理后，使用胰酶消化细胞，加入DMEM完全培养基终
MPTP）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试 止消化，制成细胞悬液，以 3 500 r/min 离心 10 min 后收

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