Page 49 - 《中国药房》2024年3期
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2.2 p53在小檗碱诱导MG63细胞铁死亡中的作用                         2.3.2 过表达 STAT3 对细胞中 p-STAT3、STAT3、p53 和
          2.2.1 p53 siRNA转染与细胞分组                             SLC7A11蛋白表达的影响
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              将细胞按照2×10 个/孔的密度接种于6孔板中，待                          按照“2.3.1”项下方法进行细胞接种、分组与处理。
          细胞融合度达到 60% 左右进行转染。按转染试剂说明                         培养结束后，按照“2.1.9”项下方法检测细胞中p-STAT3、

          书配制 p53 siRNA 和 NC siRNA 的转染体系，分别转染                STAT3、p53 和 SLC7A11 蛋 白 表 达 水 平 。 p-STAT3、
          细胞6 h后更换培养液继续培养48 h。将细胞分为对照                        STAT3、p53 和 SLC7A11 一抗的稀释比例均为 1∶1 000，
          组（细胞经 NC siRNA 处理）、p53 siRNA 组（细胞经 p53
                                                             GAPDH 一抗的稀释比例为 1∶4 000。以各目的蛋白与
          siRNA 处理）、小檗碱组（细胞经 NC siRNA 处理后再用
                                                             内参蛋白GAPDH条带的灰度值比值表示目的蛋白的表
          10 μmol/L 的小檗碱处理）、p53 siRNA+小檗碱组（细胞
                                                             达水平。
          经p53 siRNA处理后再用10 μmol/L的小檗碱处理），每
                                                             2.4 统计学方法
          组设3个复孔，加入空白培养基/含药培养基孵育24 h。
                                                                 采用 GraphPad Prism 5.01 软件进行统计分析。计
          2.2.2 p53 siRNA对细胞中p53和SLC7A11蛋白表达的
          影响                                                 量资料以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，
              取细胞按照“2.2.1”项下方法进行接种、分组与处                      组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          理。培养结束后，按“2.1.9”项下方法检测细胞中 p53 和                    3 结果
          SLC7A11 蛋白表达水平。p53、SLC7A11 和 GAPDH 一               3.1  小 檗 碱 对 MG63 细 胞 铁 死 亡 和 STAT3/p53/
          抗的稀释比例分别为 1∶1 000、1∶1 000 和 1∶4 000。以              SLC7A11信号通路的影响结果
          p53、SLC7A11 与内参蛋白 GAPDH 条带的灰度值比值                   3.1.1 小檗碱对MG63细胞存活率的影响

          表示p53、SLC7A11蛋白的表达水平。                                  与对照组[（100.00±1.75）%，n＝6]比较，2.5、5.0、
          2.2.3 p53 siRNA对细胞线粒体膜电位的影响
                                                             10.0 μmol/L 小檗碱处理组细胞 24 h 的存活率[分别为
              取细胞按照“2.2.1”项下方法进行接种、分组与处
                                                            （81.62±1.94）%、（68.58±1.62）%、（56.96±1.80）%，n＝
          理。培养结束后，加入 TMRE 染色工作液，放置在培养
                                                             6]均显著降低（P＜0.01）。
          箱中孵育30 min；采用荧光显微镜观察，采用Image J软
                                                             3.1.2 小檗碱对细胞中Ki67蛋白表达水平的影响
          件分析线粒体膜电位变化。
                                                                 与对照组[（100.00±2.09）%，n＝3]比较，2.5、5.0、
          2.2.4 p53 siRNA 对细胞中 MDA 含量和 GSH 水平的
          影响                                                 10.0 μmol/L 小檗碱处理组细胞中 Ki67 蛋白表达水平
              取细胞按照“2.2.1”项下方法进行接种、分组与处                      [ 相 对 荧 光 强 度 分 别 为（71.36±2.23）% 、（45.58±
          理。培养结束后，按“2.1.7”项下方法检测细胞中 MDA                      1.75）%、（34.92±1.44）%，n＝3]均显著降低（P＜0.01），
          含量与GSH水平。                                          且 Ki67 蛋白的表达水平有随着药物浓度增加而逐渐降
          2.3 过表达 STAT3 对经小檗碱处理的 MG63 细胞中                    低的趋势。结果见图1。
          p53/SLC7A11信号通路的影响                                 3.1.3 小檗碱对MG63细胞线粒体超微结构的影响
          2.3.1 STAT3过表达质粒的转染与细胞分组                               经不同浓度的小檗碱处理后，MG63 细胞线粒体体
                                   5
              将 MG63 细胞按照 2×10 个/孔的密度接种于 6 孔                 积逐渐变小，线粒体膜破裂，线粒体嵴减少或消失。结
          板中，待细胞密度达到70%时，向每孔中加入800 μL完
                                                             果见图2。
          全培养基（不含抗生素），待转染。用超微量分光光度计
                                                             3.1.4 小檗碱对MG63细胞内Fe 水平的影响
                                                                                         2+
          检测质粒浓度。取pEGFP-N1和pEGFP-N1-STAT3质粒
                                                                 与对照组比较，小檗碱各浓度处理组细胞内 Fe 水
                                                                                                          2+
          各4 μg，按照转染试剂说明书方法进行细胞转染。将细
                                                             平均显著升高（P＜0.01），且有随着药物浓度增加而逐
          胞分为对照组（转染 pEGFP-N1 质粒）、小檗碱组（转染
                                                             渐升高的趋势。结果见图3、表1。
          pEGFP-N1 质粒后再用 10 μmol/L 小檗碱处理）、STAT3
          组（转染 pEGFP-N1-STAT3 质粒）、STAT3+小檗碱组（转               3.1.5 小檗碱对MG63细胞内ROS水平的影响
          染 pEGFP-N1-STAT3 质粒后再用 10 μmol/L 小檗碱处                  与对照组比较，小檗碱各浓度处理组细胞内ROS水
          理），每组设3个复孔，加入空白培养基/含药培养基孵育                         平均显著升高（P＜0.01），且有随着药物浓度增加而逐
          24 h后进行以下检测。                                       渐升高的趋势。结果见表1、图4。


          中国药房  2024年第35卷第3期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 3    · 299 ·
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