Page 48 - 《中国药房》2024年3期
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2 方法                                                2.1.6 MG63细胞内ROS水平的检测
          2.1  小 檗 碱 对 MG63 细 胞 铁 死 亡 和 STAT3/p53/                将细胞按照 1×10 个/孔的密度接种于 12 孔板中，
                                                                                 5
          SLC7A11信号通路的影响                                      按照“2.1.1”项下方法进行分组（每组设 3 个复孔）、给药
          2.1.1 细胞分组及处理                                       与处理。处理结束后加入用无血清培养基稀释的
              参考预实验结果，将细胞分为对照组和不同浓度                           H2DCFDA 探针（10 μmol/L），继续孵育 30 min。DAPI
         （2.5、5.0、10.0 μmol/L）小檗碱处理组。除对照组不作干                  染核后用荧光显微镜拍照，采用 Image J 软件测定 ROS
          预外，其余各组MG63细胞分别加入含上述药物的培养
                                                              的平均荧光强度来表示ROS水平。
          基，常规培养24 h后进行以下检测。
                                                              2.1.7 MG63细胞内MDA含量和GSH水平的检测
          2.1.2 MG63细胞存活率的检测
                                                                  将细胞按照 2.5×10 个/孔的密度接种于 6 孔板中，
                                                                                   5
                              3
              将细胞按照 5×10 个/孔的密度接种于 96 孔板中，
                                                              按照“2.1.1”项下方法进行分组（每组设 3 个复孔）、给药
          按“2.1.1”项下方法进行分组（每组设 6 个复孔）、给药和
                                                              与处理。处理结束后，收集细胞，严格按照检测试剂盒
          培养。处理结束后，每孔中加入CCK-8工作液10 μL，随
                                                              说明书方法操作，使用酶标仪分别在530、410 nm波长条
          后继续培养 30 min。以不加细胞和药物的空白培养基
                                                              件下测定A，计算MDA含量和GSH水平。
          为空白组，采用酶标仪在450 nm波长条件下测定各孔细
                                                              2.1.8 MG63细胞内STAT3与DNA结合活性的检测
          胞的吸光度（A），并计算细胞存活率：细胞存活率（%）＝
                                                                  采用EMSA试剂盒进行检测。将细胞按照2.5×10                  5
         （A 实验组－A 空白组 ）/（A 对照组－A 空白组 ）×100%。
                                                              个/孔的密度接种于6孔板中，按照“2.1.1”项下方法进行
          2.1.3 MG63细胞中Ki67蛋白表达水平的检测
                              5
              将细胞按照 1×10 个/孔的密度接种于 12 孔板中，                    分组（每组设3个复孔）、给药与处理。按照试剂盒说明
          按照“2.1.1”项下方法进行分组（每组设 3 个复孔）、给药                     书方法提取细胞核蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度。

          和培养，然后用4%多聚甲醛固定细胞20 min；以免疫染                        按照EMSA试剂盒说明书要求配制反应体系，加入生物
          色通透液透化10 min后，加入免疫染色封闭液封闭1 h；                       素标记的STAT3探针，室温静置25 min。进行非变性聚
          加入 Ki67 一抗（稀释比例为 1∶200），4 °C 孵育过夜；加                 丙烯酰胺凝胶电泳，最后与链霉亲和素标记辣根过氧化
          入 Alexa Fluor 647 标记的山羊抗兔荧光二抗（稀释比例                  物酶（streptavidin-HRP）反应后经化学发光法进行成像，
          为 1∶200），室温下避光孵育 2 h；DAPI 染核 10 min 后用              采用Image J软件检测STAT3与DNA的结合活性。
          荧光倒置显微镜进行拍照观察，采用 Image J 软件计算                       2.1.9 MG63 细胞内 p-STAT3、p53 和 SLC7A11 蛋白表
          其相对荧光强度来表示蛋白表达水平。                                   达水平的检测
          2.1.4 MG63细胞中线粒体超微结构观察
                                                                  采用 Western blot 法进行检测。将细胞按照 2.5×
                              5
              将细胞按照 1×10 个/孔的密度接种于 12 孔板中，
                                                                5
                                                              10 个/孔的密度接种于 6 孔板中，按照“2.1.1”项下方法
          按照“2.1.1”项下方法进行分组（每组设 3 个复孔）、给药
                                                              进行分组（每组设3个复孔）、给药与处理。处理结束后，
          与处理。处理结束后，用 2.5% 戊二醛在 4 °C 下固定过
                                                              收集细胞并充分裂解，提取细胞中总蛋白，采用BCA法
          夜，之后加入 1% 锇酸，放置 2 h 后用乙醇和丙酮进行脱
                                                              测定蛋白浓度后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶
          水；待包埋固化后进行切片（切片厚度 50 nm），用 3% 醋
                                                              电泳（起始电压 80 V，待样品基本平齐后将电压转为
          酸铀-枸橼酸铅进行双染色，最后用透射电镜观察线粒
                                                              120 V，待溴酚蓝到达分离胶底部时终止电泳），转膜（恒
          体超微结构变化。
                                                              流 250 mA，转膜时间 2 h），封闭（5% 脱脂奶粉）；加入 p-
          2.1.5 MG63细胞内Fe 水平的检测
                              2+
                                                              STAT3、p53、SLC7A11、GAPDH一抗（除GAPDH一抗的
                              5
              将细胞按照 1×10 个/孔的密度接种于 12 孔板中，
                                                              稀释比例为 1∶4 000 外其余一抗的稀释比例均为 1∶
          按照“2.1.1”项下方法进行分组（每组设 3 个复孔）、给药
          与处理。处理结束后，用无血清的细胞培养基将细胞洗                            1 000），4 °C 孵育过夜；漂洗结束后，加入辣根过氧化酶
          涤3次，加入1 μmol/L的FerroOrange荧光探针工作溶液                  标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比例为1∶2 000），室温孵
          避光孵育30 min，之后用DAPI染核5 min。采用荧光倒                     育1 h。采用化学发光图像分析系统成像后，采用Image
          置显微镜进行拍照，采用 Image J 软件测定荧光强度来                       J软件进行灰度分析，以目的蛋白和内参蛋白GAPDH条
                2+
          表示Fe 水平。                                            带的灰度值比值计算目的蛋白的表达水平。

          · 298 ·    China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 3                               中国药房  2024年第35卷第3期
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