Page 35 - 《中国药房》2024年3期
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1.3 细胞株及动物                                         将热刺痛仪红外加热中心置于裸鼠后脚掌中心，打开电
              人肝癌 Huh7 细胞株（批号 CL-0120）购自武汉普诺                 源，仪器开始加热并计时，等裸鼠因疼痛抬足后，仪器暂
          赛生命科技有限公司。本研究所用动物为 SPF 级雄性                         停加热并停止计时，此时记录的时间为裸鼠的热刺激缩
          BALB/c裸鼠，共40只，体重（22±2） g，购自北京维通利                   足反应潜伏期。
          华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK                          2.5 样本取材及处理
         （京）2021-0006。本研究所涉及的动物实验均符合新疆                           末次给药 24 h 后，眼球取血 0.7～1 mL，取出全血
          医科大学动物伦理委员会的相关要求，伦理批准号为                            0.1 mL用于血常规指标检测；剩余全血以3 000 r/min离
          IACUC-20180222-62。                                 心 10 min，收集上层血清，于－80 ℃下保存，用于肝、肾
          2 方法                                               功能指标检测。采用颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离出肿
          2.1 药物制备                                           瘤、脾脏组织，用生理盐水清洗干净，并用吸水纸吸去组
              根据护肝布祖热原方组成，称取菊苣子 40 g、芹菜                      织多余水分，称重，然后分别固定在 4% 多聚甲醛中，用
          根40 g、茴香根皮40 g、菊苣根20 g、芹菜子20 g、小茴香                 于组织病理形态学观察。
          20 g、菟丝子10 g，混合粉碎，加水煎煮3次，煎煮时间分                     2.6 血常规指标检测
          别2、1.5、1 h，合并3次煎液，过滤，浓缩干燥滤液得干浸                         取“2.5”项下全血，使用血细胞分析仪测定全血中红
          膏，得率为18.82%。称取适量护肝布祖热方浸膏或奥沙                        细胞、白细胞和血小板数量。
          利铂，用无菌超纯水稀释至给药浓度。                                  2.7 抑瘤率及脾脏系数检测
          2.2 建模、分组与给药                                           称定“2.5”项下肿瘤、脾脏组织质量，并计算抑瘤率
              将人肝癌Huh7细胞复苏后接种至含10%胎牛血清                       和脾脏系数。抑瘤率＝（模型组平均瘤重－实验组平均
          的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养至                      瘤重）/模型组平均瘤重×100％；脾脏系数＝脾脏质量
          细胞密度为 80%～90% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化，每                  （mg）/裸鼠体重（g）。
          2～3 d传代1次。按照随机数字表法选取8只裸鼠作为                         2.8 血清中肝、肾功能指标检测
          空白组，其余32只裸鼠复制荷瘤模型。用磷酸盐缓冲液                              取“2.5”项下冻存的血清样品，按照对应的试剂盒说
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          调整细胞密度为 5×10 个/mL，取 0.1 mL 接种于裸鼠右                  明书，采用酶标仪检测血清中AST和肌酐水平。
          侧腋下，待裸鼠右侧腋下出现黄豆粒大小的肿瘤即视为                           2.9 肿瘤组织病理形态学观察
                  [12]
          造模成功 。本研究造模成功率为100%。                                   采用苏木素-伊红（HE）染色法进行观察。将“2.5”
              将造模成功的 32 只裸鼠按完全随机数字表法分为                       项下肿瘤组织放入4%甲醛中固定、脱水、包埋、切片（切
          模型组、护肝布祖热方组、奥沙利铂组和联合用药组，每                          片厚度5 μm）后，行常规HE染色，然后在显微镜下观察
          组8只。空白组和模型组裸鼠每天灌胃生理盐水0.1 mL；                       组织病理学变化。
                                                       [13]
          奥沙利铂组裸鼠每周腹腔注射奥沙利铂（10 mg/kg）                        2.10 肿瘤组织中自噬和凋亡相关蛋白的表达水平检测
          1次，即于实验第0、7、14、21、28天各注射1次，每只裸鼠                        采用免疫组化法进行检测。取“2.9”项下裸鼠肿瘤
          注射0.2 mL；护肝布祖热方组裸鼠灌胃0.69 g/kg护肝布                   组织切片浸泡于不同浓度的二甲苯中脱蜡，使用不同浓
          祖热方浸膏溶液（根据成人临床用量换算而得）；联合用                          度的乙醇浸泡进行水化，柠檬酸微波修复，滴加内源性
          药组裸鼠每周按上述剂量腹腔注射奥沙利铂1次，同时                           过氧化物阻断剂后室温孵育，然后加入血清进行封闭。
          每天灌胃护肝布祖热方浸膏溶液。护肝布祖热方共给                            封闭结束后，分别滴加 Bax（稀释比例为 1∶500）、Bcl-2
          药32 d，每天给药1次。                                     （稀释比例为 1∶500）、Caspase-3（稀释比例为 1∶150）、
              在给药第1天，空白组、模型组和奥沙利铂组裸鼠由                        LC3（稀释比例为1∶300）、p62（稀释比例为1∶500）抗体，
          于操作原因各死亡 1 只，给药第 4 天模型组和护肝布祖                       4 ℃孵育过夜；滴加二抗，使用 DAB 显色、苏木素染核、
          热方组裸鼠由于操作原因各死亡 1 只，给药第 8 天联合                       分化、脱水、透明、封片后，在显微镜下观察肿瘤组织抗
          用药组裸鼠由于操作原因死亡1只。由于裸鼠损耗，最                           原表达情况。每张切片在显微镜下选取3个视野进行观
          终每组取6只裸鼠用于后续实验。                                    察，以棕黄色为阳性表达。采用 Image J 软件计算蛋白
          2.3 一般状况及肿瘤体积观察                                    的平均光密度值，平均光密度值越大说明蛋白表达水平
              实验期间观察裸鼠精神状态、活动量、饮食、排泄等                        越高。
          一般情况，分别在给药第 0、4、8、12、16、20、24、28、32 天              2.11 统计学方法
          观察并记录裸鼠体重及肿瘤体积变化，其中肿瘤体积                                使用 SPSS 25.0 软件对实验数据进行统计分析，使
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         （V）＝1/2肿瘤最长直径（a）×肿瘤最短直径（b）。                         用 GraphPad Prism 8 软件作图。计量资料以 x±s 表示，
          2.4 热刺激缩足潜伏期检测                                     多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用
              给药第 30 天，将裸鼠放入热刺痛仪，待裸鼠稳定后                      LSD-t检验。检验水准α＝0.05。


          中国药房  2024年第35卷第3期                                                 China Pharmacy  2024 Vol. 35  No. 3    · 285 ·
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